皮膚創(chuàng)傷愈合和增生性瘢痕動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

周思政　綜述　李青峰　審校

人皮膚深層創(chuàng)傷后通過纖維性修復(fù)的方式進(jìn)行愈合[1]。該過程中，創(chuàng)面基底肉芽組織增生，支持創(chuàng)緣表皮增殖，并向創(chuàng)面中央遷移，最終覆蓋創(chuàng)面，完成愈合[2-3]。由于皮膚的修復(fù)能力有一定的限度，大面積皮膚缺損往往愈合時(shí)間較長(zhǎng)；同時(shí)，一些基礎(chǔ)疾病可能會(huì)干擾創(chuàng)傷愈合的進(jìn)程，使傷口遷延不愈，這些問題目前在臨床上仍缺乏良好的對(duì)策[4-5]。皮膚傷口的纖維性修復(fù)雖然恢復(fù)了皮膚的完整性和表皮的屏障作用，但主要是通過肉芽組織增生填補(bǔ)皮膚的缺損，愈合后不可避免地遺留瘢痕[6]。皮膚傷口愈合后產(chǎn)生的普通瘢痕，在形成后迅速進(jìn)入成熟期，期間細(xì)胞發(fā)生凋亡、膠原重排、血管密度降低，瘢痕顏色逐漸變淡、質(zhì)地變軟[7-8]。若皮膚創(chuàng)傷愈合過程中炎癥反應(yīng)過度[9-10]，或創(chuàng)面受到機(jī)械張力牽拉[11]，則可能誘導(dǎo)增生性瘢痕的產(chǎn)生。增生性瘢痕的增生期明顯，期間細(xì)胞增殖活躍、膠原大量沉積、多種生長(zhǎng)因子（如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、胰島素樣生長(zhǎng)因子1等）異常高表達(dá)[12-13]，導(dǎo)致瘢痕隆起、顏色發(fā)紅、質(zhì)地變硬、易產(chǎn)生攣縮，可導(dǎo)致患者局部外觀和功能受損，并產(chǎn)生嚴(yán)重的心理影響，是臨床一大難題[14]。

長(zhǎng)期以來(lái)，大量的研究針對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合、瘢痕形成的病理生理機(jī)制及治療方法進(jìn)行探索。由于人皮膚創(chuàng)面和瘢痕標(biāo)本在臨床的取材常常受到限制，因此這一領(lǐng)域的大部分研究需建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。但是，種系間的差異使得常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從皮膚結(jié)構(gòu)、創(chuàng)面愈合過程到瘢痕形成、瘢痕增生等多個(gè)環(huán)節(jié)，均與人體存在較大差別[15]，為實(shí)驗(yàn)研究帶來(lái)了很大的困難。本文針對(duì)目前皮膚創(chuàng)傷愈合和增生性瘢痕動(dòng)物模型的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為最終攻克瘢痕難題提供線索。

1　皮膚創(chuàng)傷愈合模型

1.1　嚙齒類動(dòng)物創(chuàng)傷模型

嚙齒類動(dòng)物易管理，建模方法相對(duì)簡(jiǎn)便，基因編輯、在體示蹤等生物學(xué)技術(shù)在該類動(dòng)物中的應(yīng)用日趨成熟。因此，嚙齒類動(dòng)物的創(chuàng)傷模型在實(shí)驗(yàn)研究中最為常用。在上世紀(jì)40年代即有報(bào)道利用小鼠觀察致癌物對(duì)皮膚創(chuàng)傷愈合的影響[16]，之后SD大鼠、Lewis大鼠、BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠等均用于建立皮膚創(chuàng)傷愈合模型[17-20]。在嚙齒類動(dòng)物中建立的模型包括線性切割傷口模型、皮膚切除創(chuàng)傷模型、熱損傷模型、感染性創(chuàng)面模型等。

線性切割傷口模型、皮膚切除創(chuàng)傷模型通常于嚙齒類動(dòng)物背部皮膚進(jìn)行，傷口大小不一、深度各異。除了應(yīng)用手術(shù)刀、手術(shù)剪制造傷口外，為了提高建模的穩(wěn)定性和使傷口標(biāo)準(zhǔn)化，皮膚打孔器[21]、植皮刀[22]等亦常用于該類模型的建立。熱損傷模型有多種建模方式，有將動(dòng)物皮膚浸泡于熱水中引起皮膚燙傷的[23]，亦有應(yīng)用加熱的金屬對(duì)皮膚進(jìn)行熱損傷的[24]。感染性創(chuàng)面的建模，則通過局部涂抹或注射微生物懸液制備，較多的是采用金黃色葡萄球菌[25]和銅綠假單胞菌[26]。

嚙齒類動(dòng)物皮膚創(chuàng)傷愈合模型被用于觀察傷口愈合過程及新治療方法的效果。但是，嚙齒類動(dòng)物皮膚伸縮性較強(qiáng)，皮膚與皮下組織間較為疏松，皮下存在易于收縮的肉膜層，導(dǎo)致了創(chuàng)面形成后創(chuàng)緣容易收縮[22，27]，使創(chuàng)面縮小。Chen等[28]報(bào)道小鼠背部傷口愈合過程中，傷口閉合約60%的力量來(lái)自于創(chuàng)緣收縮。因此，嚙齒類動(dòng)物創(chuàng)面閉合的速度相對(duì)較快，愈合過程中肉芽增生較弱，病理生理過程與人體差異較大。另外，嚙齒類動(dòng)物在皮膚愈合后，創(chuàng)面瘢痕會(huì)繼續(xù)收縮，出現(xiàn)明顯的萎縮，大創(chuàng)面愈合后約2個(gè)月時(shí)可出現(xiàn)毛囊再生等現(xiàn)象[29]，與人體皮膚存在根本性地差異。應(yīng)用藥物或基因敲除技術(shù)可建立糖尿病小鼠或大鼠模型[30-31]，這類動(dòng)物皮膚創(chuàng)面的愈合功能受損，創(chuàng)面收縮減弱，但由于動(dòng)物存在基礎(chǔ)疾病，使這類動(dòng)物模型的應(yīng)用受到限制。Wu等[32]在大鼠背部傷口皮下植入明膠海綿，使傷口的炎癥反應(yīng)加重，愈合后瘢痕的寬度擴(kuò)大了11倍，但該方法在創(chuàng)面引入了異物，對(duì)創(chuàng)面修復(fù)的過程形成了干擾。Wang等[33]提出，在背部創(chuàng)面周圍使用一硅膠圈防止創(chuàng)緣收縮，可更好地模擬人創(chuàng)面愈合、瘢痕形成的過程，但嚙齒類動(dòng)物較為活躍，實(shí)驗(yàn)過程中硅膠圈易損壞或脫落，導(dǎo)致建模的穩(wěn)定性欠佳。

1.2　豬皮膚創(chuàng)傷愈合模型

常用于建立皮膚創(chuàng)傷愈合模型的豬種包括約克郡豬[34]、杜洛克豬[35]和體型較小的尤卡坦豬[36]、漢福德豬[37]等。豬皮膚創(chuàng)傷愈合模型包括皮膚切除模型和熱損傷模型，與嚙齒類動(dòng)物建模方式類似，分別用手術(shù)器械、皮膚打孔器、植皮刀或加熱后的金屬來(lái)制造損傷。

豬皮膚創(chuàng)傷愈合模型的最大優(yōu)勢(shì)在于豬皮膚的結(jié)構(gòu)、創(chuàng)傷愈合過程與人皮膚較為接近。豬皮膚表皮與真皮厚度之比和毛發(fā)密度等，與人皮膚接近，且表皮、真皮細(xì)胞表達(dá)標(biāo)志物與人皮膚細(xì)胞有一定的相似性[38]，其創(chuàng)傷愈合過程以肉芽組織增生與表皮再生為主，與人創(chuàng)傷纖維性修復(fù)的模式也較為接近。同時(shí)，豬皮膚創(chuàng)傷愈合后可形成較明顯的皮膚瘢痕[15]。Sullivan等總結(jié)了180篇文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)78%以豬為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的創(chuàng)面研究結(jié)果與臨床研究結(jié)果一致，這一比例高于小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（53%）與體外實(shí)驗(yàn)（57%）[39]。但是，豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其飼養(yǎng)、管理?xiàng)l件和經(jīng)濟(jì)成本較高，更為重要的是很多新興的生物學(xué)手段，如基因編輯技術(shù)等，在豬模型上應(yīng)用較少，不利于對(duì)創(chuàng)面愈合的基因、分子機(jī)制進(jìn)行深入研究[40]，因此豬皮膚創(chuàng)傷愈合模型并未獲得大量的應(yīng)用。

2　皮膚增生性瘢痕模型

增生性瘢痕是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中修復(fù)反應(yīng)過度而產(chǎn)生的病理性瘢痕，病理生理機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為增生性瘢痕的產(chǎn)生與過度炎癥反應(yīng)[41]和機(jī)械張力作用有關(guān)[11，42]。一般的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)面愈合后形成的瘢痕不明顯，而且消退較快，因此增生性瘢痕模型的建立是該領(lǐng)域的一大難題。

2.1　兔耳增生性瘢痕模型

Morris等[43]發(fā)現(xiàn)兔耳皮膚創(chuàng)傷愈合后可自發(fā)形成較為穩(wěn)定、持久的增生性瘢痕，有69%的兔耳創(chuàng)面愈合后形成明顯隆起的瘢痕，且可持續(xù)90 d，組織學(xué)染色提示瘢痕組織明顯高于周邊正常皮膚，具備人增生性瘢痕的組織學(xué)特點(diǎn)。Kloeters等[44]改進(jìn)了此模型，使形成的增生性瘢痕更加穩(wěn)定。他們?cè)谕枚辖⒅睆綖? mm的創(chuàng)面，并去除兔耳的軟骨膜，使創(chuàng)面收縮變緩、愈合速度減慢，成纖維細(xì)胞持續(xù)在創(chuàng)面張力的作用下，最終導(dǎo)致增生性瘢痕的發(fā)生。進(jìn)一步研究表明，直徑7 mm的兔耳創(chuàng)面與5 mm的創(chuàng)面相比，在瘢痕過程中表達(dá)的Ⅰ型膠原和TGF-β1顯著升高[45]，提示適當(dāng)擴(kuò)大創(chuàng)面、延遲創(chuàng)面愈合可形成更明顯的增生性瘢痕。Qian等[41]在兔耳創(chuàng)面中加入病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，使創(chuàng)面持續(xù)發(fā)生炎癥反應(yīng)，創(chuàng)面多核白細(xì)胞數(shù)量、白介素-6表達(dá)明顯升高，創(chuàng)面愈合延遲，創(chuàng)面愈合后形成的增生性瘢痕隆起更為明顯，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)增多，該模型可用于炎癥性創(chuàng)面與增生性瘢痕的研究。Friedrich等[46]在兔耳上建立燒傷創(chuàng)面，與皮膚切除創(chuàng)面相比，其形成的瘢痕面積顯著增加，適合用于燒傷病理生理過程、燒傷后瘢痕形成的研究。

但是，兔耳模型暴露了兔耳的軟骨，使得創(chuàng)面基底與一般情況下人皮膚創(chuàng)面的基底條件有差異；另外，兔耳瘢痕增生的同時(shí)出現(xiàn)了軟骨的增生[44]，提示兔耳瘢痕增生的機(jī)制可能與人增生性瘢痕形成的機(jī)制存在差別。

2.2　免疫缺陷小鼠移植模型

Polo等[47]成功地將人增生性瘢痕標(biāo)本移植至免疫缺陷小鼠皮下，移植的瘢痕組織可保留人增生性瘢痕的特點(diǎn)。隨后，Momtazi等[48-49]指出，將人刃厚皮片移植至免疫缺陷小鼠背部皮膚缺損處亦可產(chǎn)生瘢痕，瘢痕組織內(nèi)可見成纖維細(xì)胞、肥大細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)decorin表達(dá)下降、二聚糖表達(dá)上升，符合人增生性瘢痕的特點(diǎn)。他們還發(fā)現(xiàn)該模型在TCRαβ-/-γδ-/-、RAG-1-/-和RAG-2-/-γc-/-免疫缺陷小鼠中均可建立，有利于研究不同類型的免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞）在增生性瘢痕形成中的作用[50]。Zhu等[51]在此類模型中應(yīng)用氯膦酸二鈉脂質(zhì)體誘導(dǎo)裸鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞凋亡，發(fā)現(xiàn)瘢痕內(nèi)的肌成纖維細(xì)胞數(shù)量、膠原合成均下降，提示巨噬細(xì)胞促進(jìn)裸鼠皮片移植導(dǎo)致的增生性瘢痕形成。

此類模型中，移植的增生性瘢痕所處的微環(huán)境與人增生性瘢痕差異較大，瘢痕的形成由皮膚移植而非創(chuàng)傷愈合導(dǎo)致。同時(shí)，裸鼠免疫系統(tǒng)存在缺陷，所以該類模型亦存在局限性。

2.3　豬增生性瘢痕模型

雌性杜洛克豬皮膚具有和人皮膚類似的皮膚錐體結(jié)構(gòu)，其皮膚創(chuàng)面愈合后可形成纖維增生性的瘢痕[52-53]，所形成的瘢痕在膠原排列、膠原表達(dá)、生長(zhǎng)因子（TGF-β1、IGF-1、VEGF）表達(dá)，以及蛋白聚糖表達(dá)、一氧化氮（NO）表達(dá)、神經(jīng)密度和微血管密度等方面，與人增生性瘢痕有較高的相似性[53-57]。研究提示，雌性杜洛克豬皮膚創(chuàng)傷后第2天、第4天可在創(chuàng)面處檢測(cè)到與組織纖維化相關(guān)的纖維細(xì)胞[58]。體外實(shí)驗(yàn)表明，雌性杜洛克豬與約克郡豬相比，其皮膚中的成纖維細(xì)胞黏附性、收縮性較強(qiáng)，遷移減弱，同時(shí)TGF-β1、α-SMA及Ⅰ型膠原表達(dá)上升、decorin表達(dá)下降，成纖維細(xì)胞的這些促纖維化特性可能導(dǎo)致了杜洛克豬易于形成增生性瘢痕[59]。Travis等[60]發(fā)現(xiàn)杜洛克豬瘢痕外周色素加深，該區(qū)域中黑色素、α-黑素細(xì)胞刺激素等表達(dá)升高，黑色素細(xì)胞的激活更為顯著，提示該模型亦可用于研究創(chuàng)傷愈合和瘢痕形成中黑色素細(xì)胞的作用。

盡管豬瘢痕模型在組織學(xué)、病理生理學(xué)方面與人體較為接近，但其形成的瘢痕在外觀上并未發(fā)紅、隆起，豬深層創(chuàng)面愈合需要約3個(gè)月，建模時(shí)間較長(zhǎng)；另外，動(dòng)物管理、費(fèi)用等問題，亦限制了此模型的廣泛應(yīng)用。

2.4　小鼠皮膚傷口牽張模型

臨床觀察發(fā)現(xiàn)，人體皮膚傷口受到機(jī)械牽張與增生性瘢痕的發(fā)生具有相關(guān)性，應(yīng)用減張的方法可有效減少增生性瘢痕的發(fā)生[61]。因此，Arabi等[11]在小鼠背部安裝一皮膚牽張器，對(duì)小鼠背部切割傷口在愈合后施加10 d的機(jī)械牽張力，誘導(dǎo)了增生性瘢痕的產(chǎn)生，并符合人皮膚增生性瘢痕的特點(diǎn)。該研究證實(shí)，在此模型中，機(jī)械張力使瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞凋亡受到抑制，從而使膠原沉積、瘢痕增生。同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)機(jī)械張力通過輔助T細(xì)胞介導(dǎo)小鼠瘢痕內(nèi)出現(xiàn)持續(xù)慢性炎癥反應(yīng)，巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞募集增多，促纖維化生長(zhǎng)因子表達(dá)升高，導(dǎo)致增生性瘢痕的產(chǎn)生[62]，提示該模型在增生性瘢痕形成的免疫學(xué)機(jī)制上與人有相似之處。進(jìn)一步的研究中，他們還利用基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)機(jī)械張力激活一類與細(xì)胞連結(jié)、遷移相關(guān)的分子——局部粘著斑激酶（FAK），通過FAKERK-MCP-1信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致瘢痕內(nèi)炎癥反應(yīng)加重，瘢痕增生[63]。該發(fā)現(xiàn)將增生性瘢痕發(fā)生的二大因素——機(jī)械力與炎癥反應(yīng)相聯(lián)系，一定程度上解釋了生物力學(xué)在瘢痕增生中所起的具體作用，該模型成為目前較為常用的增生性瘢痕模型。但由于小鼠活動(dòng)活躍，建模過程中牽張器經(jīng)常受損脫落，導(dǎo)致模型建立不穩(wěn)定，影響實(shí)驗(yàn)研究的可重復(fù)性。

2.5　藥物誘導(dǎo)小鼠增生性瘢痕的產(chǎn)生

博來(lái)霉素被用于建立肺纖維化、硬皮病的動(dòng)物模型[64-65]。因此，Cameron等[66]在BALB/c小鼠背部皮下置入微泵，以恒定的速度注入博來(lái)霉素，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)皮膚產(chǎn)生增生性瘢痕，所產(chǎn)生的瘢痕組織具備人皮膚增生性瘢痕的特點(diǎn)，認(rèn)為此模型可用于增生性瘢痕的研究。但是，這樣的瘢痕并非由皮膚損傷發(fā)展而來(lái)，其形成過程與人皮膚增生性瘢痕相差較遠(yuǎn)，并且皮下應(yīng)用博來(lái)霉素后，可能與瘢痕的藥物治療、細(xì)胞治療等發(fā)生相互作用，影響實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性。另外，博來(lái)霉素停止輸注后，模型的瘢痕組織可能消退，不利于長(zhǎng)期觀察[67]。

3　現(xiàn)狀與展望

皮膚創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成一直是臨床試圖攻克的難點(diǎn)，良好的動(dòng)物模型是深入研究的基礎(chǔ)，對(duì)研究結(jié)果的可靠性有重要影響。然而，由于創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成有明顯的種系特異性，纖維性修復(fù)、瘢痕增生等過程往往在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上難以很好地重現(xiàn)，各種動(dòng)物模型的優(yōu)缺點(diǎn)均很明顯。豬在皮膚結(jié)構(gòu)、創(chuàng)傷愈合、瘢痕形成、瘢痕增生等方面與人體皮膚有較好的相似性，但新興生物學(xué)技術(shù)尚無(wú)法應(yīng)用。目前針對(duì)創(chuàng)傷愈合、皮膚瘢痕化的研究已達(dá)基因和分子學(xué)層面[68-69]，對(duì)于基因轉(zhuǎn)錄、信號(hào)傳導(dǎo)的研究常需利用基因編輯技術(shù)、在體示蹤技術(shù)，這些方面的不足限制了豬模型的應(yīng)用。嚙齒類動(dòng)物管理方便、費(fèi)用較低、生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用廣泛，成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的首選。但嚙齒類動(dòng)物在創(chuàng)傷愈合、瘢痕增生過程中與人體皮膚存在明顯差異，為新治療方法的臨床轉(zhuǎn)化帶來(lái)了困難。總而言之，對(duì)于皮膚創(chuàng)傷愈合和增生性瘢痕動(dòng)物模型的研究仍不完善，還需要進(jìn)一步的積極探索。目前，利用實(shí)驗(yàn)工具（如硅膠圈、皮膚牽張器等）干預(yù)動(dòng)物皮膚傷口、瘢痕，以更好地模擬人病理生理過程為建模研究的新趨勢(shì)。另外，嚙齒類動(dòng)物中基因編輯技術(shù)日臻成熟，能否利用該技術(shù)在動(dòng)物中重現(xiàn)人皮膚創(chuàng)傷愈合、瘢痕化的過程，值得進(jìn)一步探索。

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