淺談細菌素Nisin

□ 張雪穎 蘇州大學劍橋-蘇大基因組資源中心

Nisin 是由乳酸乳球菌產生的I類細菌素，由于它能有效地抑制或滅活腐敗菌和食源性病原菌而被廣泛應用于食品中。本文對Nisin 滅菌機制、調控及分離純化進行簡單介紹。

Nisin是已知的最古老和最具特征的硫醚抗生素，于1928首次被發現，并于1969批準用于食品工業。由于它能有效地抑制或滅活腐敗菌和食源性病原菌，已有50多個國家被許可用作食品防腐劑。Nisin 由乳酸鏈球菌產出，是一種具有正電荷的34個氨基酸肽，其線狀結構由五個內環和一個靈活的中樞區域組成。

Nisin的滲透細胞膜的機理是通過兩種不同的途徑實現的。一種理論是通過孔隙形成機制。Nisin通過結合一種細菌細胞被生物合成所必需的細胞膜前體，即脂類II，來連接細菌細胞 質 膜（Cytoplasma Membrane，CM）。當幾個Nisin分子聚集在一起時，就會在CM中形成孔隙。第二種理論是低親和力滲透機理。與負電荷的細菌磷脂結合后，Nisin進入磷脂的親水基之間，多個Nisin單體聚集在外層的脂質單層中，形成一個短壽命的類孔結構，使它能夠跨越脂質雙層。這兩種機制均能改變CM的形成，抑制靶細胞細胞壁的合成，從而抑制細胞的生長。一些革蘭氏陽性菌，如乳球菌、乳桿菌、皮球菌、微球菌、葡萄球菌和李斯特菌都對Nisin敏感。此外，Nisin也可以防止或抑制芽孢桿菌和梭菌的內孢子生長和營養生長。由于革蘭氏陰性菌外模的滲透屏障，使得Nisin對革蘭氏陰性菌沒有抗性。

靶細胞的一些因素，如細胞磷脂含量低、膜脂肪酸組成改變、細胞壁組成變化等，能夠影響Nisin的活性。此外，結合在細胞壁上的負電荷多糖可提高靶細胞對Nisin的抗性。

Nisin生物合成的調控

11個基因組成的基因簇，即nisABTCIPRKFEG，參與了Nisin的生物合成。基因nisA編碼nisin A前體肽；基因nisB和nisC參與翻譯后修飾反應；基因nisT參與前體nisin的易位；基因nisP參與前體加工；基因nisI和nisFEG分別參與nisin的自我保護和免疫；基因nisR和nisK參與了nisin生物合成的調控。

Nisin本身作為信號分子生物，合成受群體感應調控。在nisin生物合成的自調控過程中，兩組調控系統，即nisK和nisR，在nisin的轉錄激活和下游生產中起著重要的作用。作為一種傳感器組氨酸激酶，NisK能感覺到nisin和自磷酸化酸鹽的存在。磷酸化后，磷酸鹽基轉移到反應調節劑NisR中，誘導nisA和nisF啟動子的激活，從而合成未經修飾的前體nisin。未經修飾的前體nisin由假定的酶NisB和NisC修飾，然后通過ABC轉運體NisT跨膜轉運。通過NisP對前體nisin進行修飾后，nisin被激活并釋放。此外，NisIFEG還共同作用以防止nisin的殺菌作用對自身細胞的破壞，從而確保對宿主細胞的免疫力。

Nisin的分離純化

從食物和食品中分離Nisin的方法包含篩選乳酸菌的抗菌活性，并將得到的抗菌物質進一步分離和確定，以便確定為細菌素。一般采用軟瓊脂（0.75%）覆蓋法分離細菌素。為了排除過氧化氫產生抑制的可能性，在培養基中加入過氧化氫酶；在固體瓊脂中加入碳酸鹽或磷酸鹽緩沖液，以避免有機酸的拮抗作用。噬菌體所造成的抑制作用也可以通過排除在帶有敏感指標的瓊脂上缺乏噬菌體菌斑而確定。這種抑制活性是通過spot-onlawn方法或在帶有敏感指示物的瓊脂平板上進行擴散試驗來檢測和證實的。

Nisin是在培養基中分泌的蛋白質類化合物。在純化前，nisin需要從產生的培養物的無細胞上清液中濃縮。通常，采用硫酸銨沉淀蛋白質和用丁醇、乙醇等有機醇提取蛋白質的方法來選擇性地提取nisin。然后，通過陽離子交換、凝膠過濾、疏水作用和反相液相色譜等幾個色譜步驟純化細菌素。純化細菌素的產量往往很低，可能是由于提純步驟過多導致的。因此，優化細菌素的產生是實現細菌素濃度最大化的重要步驟。

含nisin的食品生物保存

Nisin由乳酸菌（L.lactis）產生，是唯一獲準用于某些加工奶酪、乳制品和罐頭食品中的食品防腐劑的細菌素。在食品中添加nisin可以通過減少化學防腐劑的使用和/或熱處理強度來提高加工產品的感官和營養特性。大多數情況下，乳酸菌細菌素與傳統和新的保存方法（例如高壓處理和脈沖電場）共同作用，以滅活目標腐敗菌或致病菌。這些組合之所以有效，是因為細菌細胞受到更嚴重的損害，在聯合治療后可能需要更多的能量來修復損傷，導致能量耗盡和細胞死亡。因此，食物的衛生質量得到改善，保質期得到延長。