食品中產氣莢膜梭菌的檢測分析與應用

□ 原亞梅 廣西華測檢測認證有限公司

產氣莢膜梭菌是食源性致病菌的一種，其不僅存在于自然界的土壤和水源中，也存在于人和動物的腸道中[1]。產氣莢膜梭菌各種類型中均含有α-毒素基因，其會產生α-毒素。因此，α-毒素是最基本的致病因子。近年來，人們的飲食習慣發生了顯著的變化，產氣莢膜梭菌對于食品的污染，是導致人們出現食物中毒和腹瀉的重要原因。然而，產氣莢膜梭菌是一種厭氧菌，其在檢測過程當中，由于檢測環節較為復雜，因而在檢測過程中，其準確性受到很大的影響。因此，本研究采用PCR檢測方法對30份食品污染檢測項目肉類樣品進行了檢測。在檢測過程中，有3份樣品的PCR檢測方法是陽性，采用傳統的培育方法，產氣莢膜梭菌檢出2株。PCR檢測方法的優勢在于簡便、快速以及靈敏度和特異度高，等等。

1 材料與方法

1.1 菌株

產氣莢膜梭菌ATCC 13124；類型為A型，帶有CPA毒素基因。其他菌株：腸炎沙門氏菌亞A（甲）型副傷寒ATCC 9150、福氏志賀氏菌ATCC 12022、空腸彎曲菌ATCC 33291、單核細胞增生李斯特氏菌ATCC 19115。

1.2 方法及設備

產氣莢膜梭菌培養過程中，先將樣品接種在腦心浸出液肉湯中，溫度為（37±1）℃，時間為18 h。然后，使用劃線血瓊脂平板等進行繼續培養，溫度為（37±1）℃，時間為24 h。此后，接種牛奶發酵培養基，溫度為（46±0.5）℃，時間為4 h。最后，待其符合相應要求和標準后，檢出產氣莢膜梭菌。

目前，采用的培養基是腦心浸出液肉湯（BHI）、血瓊脂平板（90 mm）、牛奶發酵培養基、生化試劑等。儀器采用的是廣州微生物科技有限公司生產的設備和法國生物梅里埃公司，所有設備驗收合格。

1.3 引物

自行設計引物和探針，引物和探針的生產廠家均是上海SANQON公司合成的。探針使用的標記是FAM。

1.4 PCR反應體系

反應體系的總體積、模板、緩沖液分別為25 μL、5 μL、2.5 μL。上下游引物以及探針均為25 pmol。PCR反應條件：溫度為94 ℃，預變性時間為5 min；溫度為94 ℃，變性時間為1 min；溫度為57 ℃，退火時間為1 min；溫度為72 ℃，時間延伸1 min；擴增30個循環；溫度為72 ℃，時間延伸15 min。采用Mx3005P熒光PCR擴增儀進行檢測。

1.5 判斷標準

樣本檢測結果的標準如下。①有效：Ct值≤35.00，檢測結果為陽性。②Ct值在35.0～40，其需要再進行一次檢測。當在Ct值＜40時，但曲線中存在較為明顯的對數增長期，則檢測結果視為陽性，否則視為陰性。同時，對于檢測不到的Ct值，其也被視為陰性。

1.6 特異性與靈敏度分析

對比沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、單核細胞增生李斯特氏菌以及產氣莢膜梭菌，分析PCR的擴增情況，主要包括DNA靈敏度和菌液靈敏度，在分析DNA靈敏度時，采用的是廣州生物公司生產的試劑盒。同時，采用可見光酸分析儀，對DNA的濃度進行定量分析。菌液靈敏度分析的過程中，是在產氣莢膜梭菌增菌后，使用比濁儀，進行提取，并采用適宜的方法進行稀釋。最后進行PCR分析。

1.7 應用評價

對30份肉類進行培養，建立PCR熒光體系，并進行擴增檢測。

2 結果

2.1 特異性分析

通過對沙門氏菌、志賀氏菌、空腸彎曲菌、單核細胞增生李斯特氏菌以及產氣莢膜梭菌的分析，其只有產氣莢膜梭菌沒有熒光信號。

2.2 靈敏度分析

通過分析產氣莢膜梭菌基因組的靈敏度，研究發現，DNA的靈敏度為10 fg，氣莢膜梭菌的菌液的靈敏度為30 CFU/PCR。

2.3 應用評價

通過對30份肉類食品的檢測，其每個樣品均有Ct值。在樣品中，PCR反應體系檢出氣莢膜梭菌3份呈現陽性，對其進行培養后，檢出氣莢膜梭菌2份。因此，相比于傳統的檢測方法，PCR檢測方法，其具有較高的特異性和靈敏性。與此同時，在監測過程中，黃鱔的檢出率最高，其檢出率為20.00%，其次是鰱魚，其檢出率為14.29%。

3 結論

通過本文的研究，研究結果表明所示，對產氣莢膜梭菌進行檢測時，采用PCR檢測方法，其具有較高的特異性，也具有較好的靈敏度。同時，這種檢測方法，其還具有較為簡單的操作方式，觀察結果也較為直觀。另外，這種檢測方法，其在檢測食品過程中，也比較快速。GB4789.13-2012檢測方法是我國已經頒布并積極推廣的檢驗方法，其對于樣品制備、活菌計數培養以及菌數計算等諸多方面均已進行了修訂和完善。本研究采用的檢驗方法，與GB4789.13-2012檢測方法相比，符合要求。因此，在食品檢測中使用這種方法是一種有效的措施和手段。