飲料中咖啡因含量檢測

□ 程水連 益陽市產商品質量監督檢驗研究院

生物傳感器（Biosensors）是由兩種主要組件所構成，一種是生物傳感器信號接收或產生部分，例如：生物體分子、組織部份或個體細胞的分子辨認元件，而另一種屬于硬件儀器組件部分，為物理信號轉換組件又稱為換 能 器（Transduction element），可將生物訊號轉換成可量化之電子訊號，以便進行數據分析及輸出處理[1]。生物傳感器定義為使用固定化的生物分 子（immobilized biomolecules）結合換能器，用來偵測生物體內或體外的環境化學物質或與之起特異性交戶作用后產生響應的一種裝置。如將前述電化學氧化-還原理論應用于生物傳感器上，便稱為電化學生物傳感器[2]。

1 電化學生物傳感器結構

電化學生物傳感器的基本結構是由三個電極所建構的一個基本單元，而這三個電極包括工作電極（Working electrode，WE）、參考電極（Reference electrode，RE）及輔助電極（Counter electrode，CE），如下所述。①工作電極一般采用透明導電玻璃，為欲研究、測試的電極。此電極不固定為陽極或陰極，而是視反應的不同而異。若在電極上發生氧化反應，此工作電極為陽極；若發生還原反應，則此工作電極為陰極。②參考電極一般采用銀/氯化銀（Ag/AgCl）電極，主要是在準確地設定工作電極上的電位；所以此電極在測定的電流范圍內，本身的電位必須幾乎維持一固定值[3]；因此，一個理想參考電極其電化學性能必須是可逆且穩定的，而且必須擁有近似于理想非極化電極（ideal nonpolarized electrode）的特性，例如高交換電流和快速的電位應答。③輔助電極是相對應于工作電極，所以可能是陰極或陽極。此電極上發生的電化學反應以不影響工作電極為原則。一般常使用白金絲作為對應電極。

每個電化學生物傳感器都需要一個信號處理裝置，即恒電位儀（Potentiostat），恒電位儀的目的是要用來維持電化學生物感測器在工作電極與參考電極之間的電化學電位，進而控制電化學反應平衡，然后將傳感器于工作電極與輔助電極之間的電流輸出，這個電流代表著待測物質中的濃度[4]。

2 電化學方法在咖啡因含量測定中的應用

咖啡因在電化學分析法中最常被利用的方法有線性掃描伏安法（Linear sweep voltammetry ，LSV）、差式脈波伏安法 （Differential Pulse Voltammetry，DPV）、 方 波 伏 安 法（Square wave voltammetry，SWV）以及循環伏安法（Cyclic voltammetry，CV）。可利用修飾過的玻璃碳電極以線性掃描伏安法檢測咖啡因標準品，其濃度范圍在 3.0×10-7～1.0×10-4M，回歸系數為 0.995、偵測極限為 1.0×10-7M，且修飾過的玻璃碳電極對咖啡因有很高的選擇性，并不會受到茶堿、抗壞血酸、葡萄糖、檸檬酸等干擾物質的影響。差式脈波伏安法（DPV）在咖啡因的檢測中，咖啡因濃度范圍在 4.0×10-5～6.0×10-4M，其回歸系數可達 0.999、偵測極限為 1.2×10-7M。干擾物質的研究，將濃度 2.0×10-5M的咖啡因標準品溶液添加各種外來物質（葡萄糖、甘胺酸、組胺酸、檸檬酸、蔗糖、果糖、次黃嘌呤等）進行檢測，結果顯示咖啡因的檢測結果并不會受到影響，而樣品的空白添加試驗，其回收率可達98.6～102 %。差式脈波伏安法具有降低背景訊號的干擾、增加訊號對噪聲的比值（S/N ratio）進而使靈敏度提高的優點，且具有非常低的偵測極限[5]。方波伏安法（SWV）在咖啡因的檢測中，咖啡因濃度范圍在 2.0×10-6～1.0×10-3M，其回歸系數為 0.999 4，標準偏差為3.03×10-7、偵測極限為 3.5×10-7M。循環伏安法（CV）主要用于探討物質在溶液中的電化學行為，藉由電位掃描所表現出波峰電位、波峰電流大小以及形狀等，判斷物質的電化學特性且實驗通常可在短時間內完成，是發展電化學系統中重要的分析工具。目前，多以循環伏安法作為探討咖啡因的特性，并未用來檢測咖啡因的含量，因此本研究將以循環伏安法作為檢測咖啡因含量的研究方法。

2.1 咖啡因在電化學氧化反應中的反應機制

咖啡因在電化學氧化反應的過程中可分為兩個步驟，首先咖啡因在氧化過程中，會失去 2e-，并在 C8和 N9端上產生氧化反應，反應產物為1,3,7-Trimethyluric acid，并得到 2H+。

持續給予電的情況下，1,3,7-Trimethyluric acid 又會再氧化成4,5-dihydroxy-1,3,7-trimethyltetrahydro-1H-purine-2,6,8-trione和4,5-dihydroxy-1,7,9-trimethyltetrahydro-110-H-purine-2,6,8-trione 兩種不穩定的化合物。咖啡因在電化學氧化反應的整體過程為 4e-和 4H+的氧化反應。咖啡因在電化學氧化反應的整體過程中會失去 4e-，可藉此測得其電流的大小，利用不同濃度的咖啡因標準品，可依電流訊號大小做出檢量線。

2.2 奈米金修飾電極

奈米金具有良好的生物兼容性、導電性、催化性能和增加表面體積等特性。近年來，奈米金已被廣泛應用于電化學上，包括生物測定、生物感測器、化學傳感器等。其中奈米金修飾電極最常應用于免疫傳感器上。免疫傳感器主要是用來偵測抗體與抗原間的相互作用，將抗原或抗體固定在傳感器（sensor）的表面。其檢測分析物的種類范圍很廣，例如醫學診斷標記（腫瘤標記、荷爾蒙等）、藥物（醫療用或違法藥物）、細菌、毒素（霍亂毒素、金黃色葡萄球菌等）、環境污染物（殺蟲劑、除草劑)）等。免疫傳感器的敏感度及特異性決定于抗體抗原的鍵結親和力與特異性及訊號轉換系統的背景雜訊。感測芯片表面的修飾也會影響傳感器的靈敏性、專一性、偵測極限、操作穩定性及保存安定性等特質。而黃金修飾過的電極能與含硫化物（雙硫鍵化合物、硫化物及硫醇等）有強烈吸附作用，此時含硫化合物會依序排列在金屬表面形成單層，在甲烯基間的凡得瓦力會使該單層方向化及穩定化。而奈米金修飾電極可以提高固定化抗體的量，作為很好的修飾材料。

3 總結

本研究以循環伏安法檢測咖啡因含量，在掃瞄過程中咖啡因會在高電位下氧化，為了避免網版電極在高電位下受到破壞，則利用奈米金修飾網版電極，藉由改變電極本身的物性來提供偵測時想要的工作電位，以供使用。