成熟液成分對卵母細胞體外成熟培養影響的研究進展

王 晨，王浩晨，周雪雁

（1．西北民族大學生命科學與工程學院，蘭州 730030；2．浙江大學醫學院，杭州 310058）

卵母細胞體外培養的成熟為動物人工輔助生殖領域拓寬了前景，體外受精、核移植、器官移植等胚胎工程技術的研究和應用越來越廣泛，卵母細胞體外培育的質量是決定胚胎生物工程研究和應用成敗的關鍵因素之一，但至今卵母細胞體外培養的效果仍然不穩定［1］。 朱平川等［2］研究發現不同培養基對卵母細胞體外發育有重要影響，趙曉娥等［3］研究發現很多生長因子對卵母細胞體外發育率有不同的影響。

1 基礎培養基對卵母細胞體外成熟培養的影響

TCM199是目前卵母細胞體外培養中使用最廣泛的一種基礎培養基，TCM199中培養的綿羊卵母細胞形態良好，極適宜進行下一步試驗。在綿羊體外受精的TCM199漸變培養體系中發現利用TCM199體外受精漸變培養體系的試驗組和對照組成熟率差異不顯著，但是能顯著提高綿羊卵母細胞體外受精后的卵裂率和桑囊率。在小鼠卵母細胞體外培養研究中，M2和M16培養液均為實驗室體外培養細胞的常用試劑，其中M2培養液是由M16培養液改進而來，由于兩者所用的緩沖液不同，導致兩者培養液具有不同的pH。M2培養液微偏酸性，M16培養液微偏堿性。經試驗研究表明，在運用M2和M16兩種不同培養液進行小鼠卵母細胞培養時，M16培養液中培養成熟率明顯高于M2培養液中培養成熟率［2］。

2 動物血清對卵母細胞體外成熟培養的影響

在基礎培養基中添加動物血清是動物細胞體外培養中最重要的一部分，動物血清對卵母細胞成熟有著至關重要的作用，可能與動物血清中化學成分尚不明確的諸多生長因子有關。唐業剛等［4］研究得到成熟液中添加血清與否對卵母細胞體外成熟率無明顯影響，但是含有血清的培養液中的卵母細胞隨后的受精卵顯著高于無血清組。有研究者認為血清的來源動物種類以及動物所處時期對卵母細胞培養有一定影響，尤其是發情期動物的血清。發情3 d羊血清對綿羊體外受精卵裂率囊胚率有明顯提高，故發情3 d的綿羊血清更適合綿羊的體外受精。原因可能是因為發情期的綿羊血清中含有大量的FSH等激素。

唐業剛等［4］認為血清并非水牛卵母細胞體外細胞成熟所必需，其采用EH和6DMAP聯合處理也可達到卵母細胞成熟的效果，且與加血清組成熟率無顯著性差異。張立蘋等［5］研究發現添加PVA的成熟液培養豬卵母細胞成熟率與血清（FBS）組無顯著性差異，故可以用PVA代替FBS。但是在使用EH或PVA代替血清時都需添加或大量添加細胞生長所需的激素與生長因子。

3 激素對卵母細胞體外成熟培養的影響

激素作為動物卵母細胞體內外培養的研究重點，許多研究者已經證明，促性腺激素能夠促進哺乳動物卵母細胞的體外成熟，促卵泡生成素（FSH）和黃體生成素（LH）是卵母細胞體外培養成熟液中最常用的2種促性腺激素，還有研究者發現用雄二醇E2和孕馬血清促性腺激素PMSG也可在體外促進卵母細胞成熟。

FSH和LH是由垂體分泌的兩種促性腺激素（Gn）。在正常的排卵周期中，FSH和LH協同發揮作用，對調控卵泡生長、卵母細胞成熟、排卵、黃體形成以及甾體激素分泌產生重要影響。研究表明FSH可以誘導卵丘細胞擴散，這是卵母細胞成熟的前提條件。FSH能促進卵丘細胞增殖分化、向外擴展并刺激卵丘細胞產生一種能促進卵母細胞成熟的細胞因子。FSH還能克服一定濃度Hx、IBMX、dbcAMP等對綿羊卵母細胞成熟的自發抑制，誘導綿羊卵母細胞恢復減數分裂成熟。

張濤等［6］研究表明，LH對山羊卵母細胞的體外成熟有一定的促進作用。目前的卵母細胞體外培養試驗中大多為FSH、LH聯合使用，經試驗得到成年母羊（牛）卵母細胞成熟培養時，在成熟液中添加濃度為10．0 ug／mL的FSH和LH，成熟率明顯提高。

4 生長因子對卵母細胞體外成熟培養的影響

大量的試驗證明在動物卵母細胞體外培養中，尤其是在無血清的動物卵母細胞培養成熟液中添加適量生長因子對卵母細胞成熟以及早期胚胎發育有重要作用。所添加的生長因子大多數是動物血清中所含有的物質，如 EGF（表皮生長因子）、IGF－I（胰島素樣生長因子－I）、GDNF（神經膠質源營養因子）、LIF（白血病抑制因子）、SCF（干細胞因子）、VEGF（血管內皮生長因子）等，這些生長因子對卵母細胞的體外培養有極大影響。

EGF（表皮生長因子）是一種局部調節因子，存在于動物體的體液和組織中，具有生物學的作用。有眾多研究指出，EGF有促進卵母細胞成熟的作用，魯進等［7］研究發現添加EGF的成熟液培養山羊卵母細胞的成熟率有所提高，但是添加量在30 μg／L以下對山羊卵母細胞體外成熟無顯著性影響。IGF－I可以誘導顆粒細胞LH受體的表達，但是在趙曉娥等［3］的研究中顯示培養液中添加IGF－I后山羊卵母細胞成熟率明顯高于對照組，尤其是EGF和IGF－I的聯合使用，顯著高于對照組卵母細胞成熟率。

GDNF、LIF和SCF在動物卵母細胞培養中一般為聯合使用，研究表明GDNF、LIF和SCF對山羊卵母細胞體外成熟有顯著影響，單獨使用SCF、LIF、GDNF濃度分別為 10、10、15 IU／mL時山羊卵母細胞成熟率最高。當三者聯用和GDNF＋LIF組效果最好，山羊卵母細胞成熟率均高于單獨使用或其他兩兩組合的成熟率。

5 抗生素對卵母細胞體外成熟培養的影響

抗生素作為一類抗菌性藥物廣泛用于預防和治療人類和動物疾病，在動物細胞培養中為了降低細胞受到污染而停止生長甚至死亡的發生被廣泛使用，目前主要使用的為青霉素、鏈霉素與離子霉素。多數研究者利用添加50 IU／mL青霉素與50 μg／mL鏈霉素的成熟液培養綿羊卵母細胞。

目前暫未出現青霉素、鏈霉素濃度對卵母細胞體外培養成熟率的研究結果，但是譚景和等［8］研究表明，高濃度（100 IU／mL）的青霉素可大大降低卵母細胞的孤雌活化率，但是適當濃度（50 IU／mL）的青霉素可使活化率出現一個峰值，故推測高濃度的青霉素可能使其成熟率降低，但是適量青霉素濃度會使其出現一個最大值。

雖然抗生素可有效避免污染的產生，但是抗生素并不是正常動物機體內環境中所含有的物質，添加抗生素會使體外培養卵母細胞的環境與正常環境有所差別，且在添加抗生素的情況下卵母細胞的成熟率是否會發生改變均有待考證。

6 含巰基化合物對卵母細胞體外成熟培養的影響

GSH（巰基乙胺）在動物細胞中有抗氧化和減少損傷的作用，在成年動物卵母細胞中GSH含量的增加發生在排卵前，并且羔羊卵母細胞合成GSH能力顯著低于成年羊。由此推測在成熟液中添加含巰基化合物（如胱氨酸、半胱氨酸、巰基乙胺和β－巰基乙醇）能夠提高細胞中GSH濃度，進而提高卵母細胞成熟率。研究顯示，添加100μmol／L巰GSH能顯著提高羔羊卵母細胞細胞核和細胞質的成熟能力。雖然成熟液中添加β－巰基乙醇對羔羊卵母細胞成熟率、胚胎卵裂率影響不顯著，但是對囊胚率影響極顯著。

7 展望

動物卵母細胞在體外成熟培養是一個極其復雜的過程，其影響因素不僅僅局限于動物卵母細胞培養成熟液的成分，其成熟還與樣品來源動物的品種、采樣年齡、采卵方式和采卵季節有關，且卵泡的直徑大小對動物卵母細胞體外成熟也有影響。應該如何建立更加完善的卵母細胞體外培養環境體系進而模擬出與動物機體內卵母細胞所處環境，對提高卵母細胞體外培養成熟率和推動動物胚胎工程發展的進程有舉足輕重的作用。

［1］岑 文．豬卵母細胞體外成熟培養及孤雌胚胎體外培養的研究［D］．西安：陜西師范大學，2015．

［2］朱平川，肖 艷．卵巢低溫保存時間與不同培養液對小鼠卵母細胞體外發育的影響［J］．黑龍江畜牧獸醫，2016（11）：221－223，289．

［3］趙曉娥，李向臣，高立功，等．山羊卵母細胞的體外成熟研究［J］．中國農學通報，2005（9）：1－3，16．

［4］唐業剛，李躍民，武建中，等．血清對水牛卵母細胞體外成熟、體外受精及早期胚胎發育的影響［J］．動物醫學進展，2005（11）：98－101．

［5］張立蘋，王亞剛，李 莉，等．成熟液中不同添加物對豬卵母細胞體外成熟及孤雌胚胎發育的影響［J］．湖北農業科學，2009，48（10）：2502－2505．

［6］張 濤，劉 超，呂麗華．LH和hCG對山羊卵母細胞體外成熟的影響［J］．畜禽業，2009（4）：40－42．

［7］魯 進，劉鳳軍，王勇勝，等．EGF和IGF－1對山羊卵母細胞體外成熟的影響［J］．黑龍江畜牧獸醫，2005（3）：7－9．

［8］譚景和，秦鵬春，馬 驥．卵齡和培養液中青霉素濃度對小鼠卵母細胞酒精孤雌活化效果的影響［J］．細胞生物學雜志，1988（2）：69－72，98．