2，3-BD多次誘導對匍匐翦股穎抗褐斑病的效果

劉興菊,馬 源，馬暉玲,余倩倩

(1.甘肅農業大學 草業學院/草業生態系統教育部重點實驗室/甘肅省草業工程實驗室/中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070； 2.華南農業大學園藝學院，廣東 廣州 510642)

馬暉玲為通訊作者。

植物病害是威脅草坪生產和管理的主要因素，長期以來，人們主要通過反復利用化學農藥等手段來防治和減輕草坪病害[1]。化學農藥的長期利用帶來了一系列副作用，如病原菌產生一定的抗藥性，環境受到污染，地下徑流中有毒有害的殘留物質增加等，使得生態系統的可持續發展受到嚴重威脅。因此，探尋新型、高效、安全、無害的病害防控手段成為病害防治中的新方向[2]。近代病理學研究發現，植物體中都存在著潛在的抗病基因，經過適當的外界因子的誘導，能夠激發植物體內抗性基因的表達，從而使植物獲得對病原物的抗性[3]。這種抗性具有廣譜性、系統性等特點，而且對環境友好，無毒副作用，有利生態系統的可持續發展。故而，探究和開發誘導植物抗病的激發子成為目前植物防治領域的研究熱點。而丁二醇(2,3-butanediol，2,3-BD)這一新型誘導劑是由假單胞菌等植物根際促生菌分泌的可揮發性有機物，常溫下為無色無味的透明液體，微生物常形成異構體混合物[4]，具有安全、無毒、對環境友好等特性，在植物抗病方面獲得廣泛的關注。

匍匐翦股穎(Agrostissoionifera)為禾本科翦股穎屬多年生草本植物，由于其葉片質地纖細柔軟，耐修剪，廣泛建植于高爾夫球場、保齡球場、運動草地等地。但是，匍匐翦股穎的抗病性很差，易感病，嚴重影響草坪功能的發揮以及觀賞價值，給草坪生產和經營帶來極大損失。因此，以ISR誘導抗病機制為基礎，采用新型誘導劑丁二醇誘導植株體內的抗病能力從而抑制褐斑病的大量爆發。

試驗采用新型誘導劑2,3-BD對匍匐翦股穎植株進行多次誘導處理，通過病情指數和誘導效果以及抗病相關酶等觀察比較2,3-BD多次誘導后，匍匐翦股穎對褐斑病的誘抗效果，以尋找2,3-BD誘導匍匐翦股穎抗褐斑病的施用次數，有效提高抗病害效果，為丁二醇誘導植物抗病害提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試匍匐翦股穎品種為Penn-A4(Agrostisstoloniferacv. Penn-A4)，由北京克勞沃公司提供。誘導劑2,3-BD購自西亞試劑。病原物為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，購自中國科學院菌種保存中心。

1.2 試驗設計

1.2.1 材料培育 營養土、沙、蛭石混合(2∶1∶1)，滅菌處理后于倒入600 mL塑料花盆，澆水，放置一夜后種植匍匐翦股穎種子。種植前種子處理，無菌水浸泡一夜，用70%乙醇溶液浸泡1 min，后用20%次氯酸鈉浸泡30 min，無菌水沖洗5～6次，種植于600 mL的花盆中，每盆0.3 g。培養在25℃的恒溫組培室中，出苗后進行間苗處理。

1.2.2 供試菌種制備 接種病原菌立枯絲核菌在PDA固體培養基中，25℃培養4 d，用滅菌的打孔器取6 mm直徑菌絲塊，于PD液體培養基，在25℃、100 r/min的搖床培養4～5 d，將培養好的立枯絲核菌用無菌水沖洗2～3次，研磨后無菌水配置成濃度為OD340=0.8的菌絲懸浮液，采用噴霧法接種。

1.2.3 種植后誘導和接種 根據前期研究采用不同濃度梯度2,3-BD誘導處理匍匐翦股穎，通過病情指數的調查和抗病相關酶等的測定，結果顯示250 μmol/L的2,3-BD是誘導匍匐翦股穎抗褐斑病的最佳濃度，此次試驗選用250μmol/L濃度的2,3-BD為誘導劑。在幼苗生長第16 d開始進行誘導處理。試驗組分設4個處理(用D1、D2、D3、D4 )，每個處理3次重復，不做誘導處理為對照組，設計方案如下：

表1 試驗處理設計方案

注： △為2，3-BD誘導劑處理；O為等量水處理

1.3 試驗方法

1.3.1 匍匐翦股穎褐斑病發病程度基本標準 接種后第7、10、15、20、25、30、35、40 d，參照文獻[5]牧草病害的調查與評定，進行病情觀察，統計病葉率并計算病情指數。匍匐翦股穎褐斑病嚴重度的分級標準如下：0級：無癥狀；1級：葉片上有零星菌絲；2級：10%～40%的葉片上有菌絲；3級：40%～60%的葉片上有菌絲體生長并有壞死跡象；4級：60%～80%的葉片上有豐富的菌絲體和壞死現象；5級：全部植株普遍感病。

病情指數(%)=

1.3.2 生理指標的測定 樣品噴菌處理后于第1、3、5、7、9 d進行酶活性的測定，于第1、5、10、15、20 d進行游離脯氨酸、丙二醛和葉綠素含量的測定。

（1）聚焦應用能力培養。由于“茶產品分析與檢驗”的實務性和技術性，教學目的主要使學生能夠應用檢驗分析的方法。所以，教學過程中要以應用能力培養為導向，以此為目的組織教學內容、選擇適合的教學方法。

超氧化物歧化酶(SOD)活性參照文獻[6]的方法并做修改，以1 min內每克鮮重△OD560減少50%為1個酶活單位；

過氧化物酶(POD)活性的測定參照文獻[7]的方法，以每分鐘酶促反應體系吸光度變化0.01為一個POD活力單位(U)；

過氧化氫酶(CAT)活力測定參照文獻[8]的方法并修改，以每分鐘反應體系吸光度值變化0.01定義為1個酶活性單位(U)；

苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性參照文獻[9]的方法并修改，以每分鐘內吸光度變化0.01為1個活性單位(U)，酶活性單位為U/(min·g·FW)；

丙二醛(MDA)的含量均參照文獻[10]的方法；

葉綠素含量的測定參照文獻[11]的測定方法略有改進。

1.4 數據分析方法

運用SPSS 19.0軟件對所有數據進行統計分析，計算標準誤、并對數據進行方差分析，利用Duncan法多重比較對差異性進行分析，運用Excel 2013進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 丁二醇多次誘導對匍匐翦股穎植株病情指數的影響

2,3-BD有效降低匍匐翦股穎褐斑病的病情指數。接種后第7，10和15 d均差異顯著(P<0.05)。并且植株CK的病情指數顯著高于2,3-BD處理，2,3-BD處理的病情指數與CK相比有明顯的抗病效果，具有顯著性差異。試驗發現在第15 d，W+J處理的病情指數最高，植株基本感病且大面積死亡。而2,3-BD處理下植株的病情指數明顯得到了抑制，效果顯著(P<0.05)。通過比較發現，誘導2次的抗病效果最佳病情指數最低，為24.6%，分別比誘導1、3、4次提高了14.2%，7.3%和8.4%。說明通過對匍匐翦股穎進行多次誘導，對植株抗病能力有一定的提高(圖1)。

2.2 丁二醇多次誘導對匍匐翦股穎植株抗病效果的影響

試驗比較發現，匍匐翦股穎經過多次誘導后能夠顯著提高植株的抗病效果，與誘導1次相比較，誘2，3和4次的處理抗病效果都有一定幅度的提升，分別是65.05%，60.31%和59.66%。說明誘導劑2,3-BD通過多次誘導處理能夠在一定程度上提升翦股穎植株的抗病能力(表2)。

圖1 丁二醇多次誘導處理下匍匐翦股穎的病情指數的影響Fig.1 Effects of 2,3-BD repeatedly induced on disease index of creeping bentgrass

誘導次數病情指數/%W+JBDO+J誘導抗病效果/%D176．4533．794355．80cD270．4524．621165．05aD374．4529．546760．31bD477．4531．243859．66b

2.3 丁二醇多次誘導對植株抗病相關酶活性的影響

2.3.1 丁二醇多次誘導對植株SOD酶活性的影響 2,3-BD誘導處理對植株SOD活性影響顯著。2,3-BD誘導處理的SOD活性在抗病初期顯著高于CK，且差異顯著(P<0.05)，接菌后第1 d植株的SOD活性迅速上升達到峰值，隨后呈逐漸降低的趨勢，但始終高于CK。CK植株SOD的活性在接種后第3 d達到峰值，之后逐漸下降，可見，2,3-BD處理能有效提高植株SOD的活性(圖2)。

通過多次誘導發現，D2和D3處理的SOD活性在前9 d都比CK活性高，下降趨勢也較D1和D4緩慢，D2處理SOD活性在第7 d時又出現上升現象，且始終比其他處理活性高，說明兩次誘導較好一些。

圖2 丁二醇多次誘導處理下匍匐翦股穎SOD的活性Fig.2 Effects of 2,3-BD repeatedly induced on superoxide dismutase of creeping bentgrass

2.3.2 丁二醇多次誘導對植株POD酶活性的影響 與CK相比，2,3-BD誘導處理的植株能夠明顯提高植物體POD活性，且差異顯著(P<0.05)。接菌后植株體內POD的活性大體呈先升高后降低再升高的趨勢，2,3-BD誘導處理整體較高。4個處理POD的活性都在第7 d有峰值，其中D1和D3有兩個峰值，且第7 d高于第3 d。D2處理的POD活性在第7 d最為活躍，分別比D1，D3 和D4處理提高了17.16%，6.67%和23.11%，是CK的1.36倍(圖3)。

2.3.3 丁二醇多次誘導對植株CAT酶活性的影響 接菌后植物體內CAT活性隨時間變化整體呈現下降再逐漸上升趨勢。接種病原菌后CK處理在第3 d急劇下降，之后持續緩慢上升。4個處理中，2,3-BD誘導處理在第1 d植物體內CAT的活性均比CK低，且有顯著差異(P<0.05)，之后其活性在第3～5 d呈緩慢下降現象，第7 d時又快速上升且達到峰值，與CK相比差異顯著。分別為CK的2.07、2.23、1.73、1.51倍，其中D2處理的CAT活性最強(圖4)。

圖3 丁二醇多次誘導處理下匍匐翦股穎POD的活性Fig.3 Effects of 2,3-BD repeatedly induced on peroxidase of creeping bentgrass

圖4 丁二醇多次誘導處理下匍匐翦股穎CAT的活性Fig.4 Effects of 2,3-BD repeatedly induced on catalase of creeping bentgrass

2.3.4 丁二醇多次誘導對植株PAL活性的影響 2,3-BD處理提高了PAL的活性，但是變化幅度較大。D1處理組，PAL的活性在第1 d達到最高值，是CK的1.19倍，之后降低，在第7 d又達到一個峰值，但與CK相比差異不顯著(P<0.05)；D2處理組中，PAL活性在第3、7 d出現2個峰值，與CK差異性顯著，其中，第3 d達到最高值，是CK的1.47倍，第7 d是CK的1.21倍。D3處理組中，2,3-BD誘導后植株體內PAL活性也在第3、7 d有峰值，第3 d酶活性達到最高，是CK的1.32倍，但比2次誘導處理低一些；D4處理組中的酶活性呈逐漸降低后增高的趨勢，第7 d出現最低值，且與CK相比酶活性降低顯著，第1 d最高，是CK的1.14倍(圖5)。

2.4 丁二醇多次誘導對植株體內葉綠素和MDA的影響

利用250 μmol/L的2,3-BD對匍匐翦股穎進行多次誘導并接種褐斑病病原菌發現，2,3-BD對葉綠素的含量和MDA的含量有一定影響。經過2,3-BD誘導的4個處理組植株體內葉綠素的含量明顯高于CK，差異顯著(P<0.05)，但處理組間差異不顯著，說明多次誘導對葉綠素影響較小。

試驗對MDA的含量比較發現，2,3-BD對MDA含量的影響較大，4個處理組中MDA的積累量均顯著低于CK，其中D2處理組的MDA積累量較其他處理組相比明顯最低(表3)。

圖5 丁二醇多次誘導處理下匍匐翦股穎PAL的活性Fig.5 Effects of 2,3-BD repeatedly induced on phenylalanine ammonia-lyas of creeping bentgrass

指標處理1d5d10d15d20d葉綠素/(mg·g-1)D12．75a2．84a2．74a2．61a2．06aD22．83a2．89a2．85a2．72a2．14aD32．73a2．79a2．54ab2．49b2．11aD42．69a2．71a2．62ab2．55ab2．02aCK2．67a2．49b2．12c1．83c1．47b丙二醛含量/(μmol·L-1)D16．3a7．31c10．19c11．28d14．35dD26．67a7．15c9．26d10．15e12．93eD36．79a7．54bc11．78b12．35c15．21cD46．95a8．29b11．35b13．05b16．37bCK6．92a9．43a13．4a15．23a19．05a

注：同列數據不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

植物誘導抗病性(ISR)是通過利用外界生物或非生物等激發因子提高植株自身抗病潛能的一種方式，最終達到抵抗外界病原菌侵染，控制住植株病害的擴散或者發生，提高植物自身的抗病能力[12]。之前已經對以丁二醇作為誘導劑使匍匐翦股穎對褐斑病產生抗性做了較多研究[13-19]。引起植物誘導抗性激發子以及產生誘導抗性的植物種類都是多樣，每一種誘導抗病植株都有其自身的特點。同時也包括一些共同的特征，即非特異性、不完全性、滯后性和耗能性等。高濃度的接種病原菌，尤其在低水平的誘導條件下，將會降低誘導抗病性的有效性。因此，試驗目的是為了探究通過多次誘導，是否對植物的抗病能力得到增強。

3.1 丁二醇誘導對植株體內葉綠素和MDA的動態變化

試驗發現，利用250 μmol/L的2,3-BD對匍匐翦股穎進行多次誘導后能顯著提高植株的抗病能力。通過對接種病原菌后第1，7和15 d植株的病情指數觀察發現，2,3-BD處理能有效降低植株的病情指數，經過兩次誘導的翦股穎植株其在抗病過程中病情指數最低，誘導效果最佳，達到了65.05%，比其他處理組的效果明顯。對植物葉綠素含量的測定以及MDA積累量的分析發現，2,3-BD處理能使葉綠素含量有所增加，當植物受到病原菌侵染后，植物體內葉綠素的含量隨時間的變化呈逐漸降低的趨勢，未誘導處理下降趨勢明顯。研究結果與徐秉良等[20]、金珠等[21]在馬齒莧抗霜霉病中葉綠素含量的變化結果相似，說明，葉綠素含量的變化與植物抗病之間存在密切的關系。葉綠素是植物光合作用的基礎，光合作用是衡量植物合成功能的重要生理指標。葉綠素含量高,葉片光合作用越強,積累的有機物質也就越多,為抵御病原菌入侵提供的能量就越多，抗性也隨之增強。病原物侵染植物后，往往能與葉綠體發生相互作用，導致葉綠體解體，發病嚴重的甚至導致葉綠素合成受阻，出現葉片褪綠、黃化或花葉等癥狀。但通過對比多次誘導的4個處理發現，葉綠素的變化與誘導的次數沒有太大的相關性，因此，多次誘導對植株的抗病能力與葉綠素的變化無相關性。

而MDA作為膜脂過氧化作用的最終產物與細胞膜的損害程度直接相關，膜脂過氧化的加劇引起質膜透性增大，致使大量電解質外滲，說明MDA含量和電導率與細胞膜的損害程度直接相關[22]。其含量與植物抗病關系密切，通過研究發現，接菌后植物體內MDA的含量隨時間的增加呈逐漸上升的趨勢，與CK相比，2,3-BD誘導處理明顯降低了植物體內MDA的積累量。同時比較多次誘導的4個處理組發現，經過兩次誘導的植株，其MDA的積累量明顯比其他處理的低，說明2,3-BD多次誘導對植株的抗病能力有一定程度的提升。

3.2 丁二醇誘導對植株抗病相關酶活性的變化

植物抗病過程中伴隨著一系列的生理生化變化和物質代謝，其中催化這些生理生化以及代謝反正的酶為關鍵因子，試驗中2,3-BD誘導處理翦股穎后能在一定程度上增強SOD、POD、CAT、PAL這4種關鍵酶。SOD是植物體內防御活性氧毒性的保護酶，它能清除超氧化物陰離子自由基，提高植物抗逆性，SOD酶的活性在第1 d達到最高，之后逐漸下降但與CK相比差異顯著且始終高于CK，通過進行多次誘導比較發現4次誘導處理SOD活性在第7 d時又出現上升現象，且始終比其他處理組活性高，試驗結果表明2,3-BD處理能有效提高植株SOD的活性，且兩次誘導的效果要更好一些。

POD是植物體內存在的清除活性氧自由基的一種重要酶，防止過氧化物含量增多，活性的高低能反映出植物體內自由基清除或抗氧化能力的強弱，可作為植物抗逆性的重要指標。因此POD酶活性的增加有利于提高植物的抗病能力。結果顯示2,3-BD誘導處理的植株能夠明顯提高植物體POD活性，多次誘導的4個處理中POD的活性都在第7 d有峰值，但兩次誘導處理的POD活性在第7 d表現最為活躍，為效抵御病原菌的入侵提供條件。

CAT也是植物體內重要的活性氧清除酶類，其作用是將H2O2降解成為無毒害的H2O和O2，維持體內的活性氧代謝平衡，保護膜結構，從而使植物能在一定程度上忍耐、減緩或抵抗逆境脅迫，因此，就成為植物在逆境中保護自身體系健康的酶系統中的一種。結果顯示，2,3-BD誘導處理使CAT的活性增加，接種病原菌后，其下降幅度也較對照緩慢，說明2,3-BD能夠使植株體內的活性氧代謝達到平衡，增加其抗病性。

PAL酶是植物產生誘導抗病性的關鍵酶類，多個研究表明在植物受到病原菌侵染時，在植物抗病初期體內的PAL酶活性會迅速升高，說明PAL酶活性的升高有利于提高植物對病原菌侵染的抗性。試驗中在接種病原菌后，PAL酶的活性變化幅度較大，但在整體分析，2,3-BD提高了PAL酶的活性，多次誘導的4個處理，不同誘導次數對植株體內酶的活性影響也不盡相同，其中經過兩次誘導處理的酶活性始終較對照高。多數的研究都表明，酶活性的提高能使植株表現出良好的抗病效果，說明2,3-BD能提高植株的抗病效果。

4 結論

使用外源誘導劑處理能提高寄主植物SOD、POD、CAT、PAL等酶的活性，與寄主抗性呈正相關性[23-27]，而MDA含量的變化與植物的抗病性呈負相關[27]，研究所測定的4種酶活性的變化和MDA含量的變化與匐翦股穎抗性的關系，與多數學者研究結果相似。試驗結果顯示2,3-BD能提高植株的抗病效果，且多次誘導抗病效果更顯著，其中施用兩次誘導劑的效果相對最好。

[1] 楊昆.珠江三角洲主要森林下植被和區域森林生物量的研究[D].廣州：中山大學,2007.

[2] 邢家華,陳定花,朱衛剛,等.植物化學誘抗劑[J].浙江化工,2002(33):51-52.

[3] Durrant,Dong X.Systemicacquired resistance[J]．Annuat Review of Phyto-pathology,2004,42:185-209.

[4] Mccorn M,Creelman R A,Bell E,etal.Jasmonate is essential for insect defenceArabidopsis[J].Proceedings of the National Academy of Seciences of USA,1997,94:5473-5477.

[5] 南志標.牧草病害的調查與評定[M]∥任繼周，草業科學研究方法).北京：中國農業版社,1998:214-236.

[6] Beyer Jr W F,Fridovich I.Assaying for superoxide dismutase activity:some large consequences of minor changes in conditions[J].Analytical biochemistry,1987,161(2):559-566.

[7] JIANG Aili,TIAN Shiping,XU Yong.Effects of controlled atmospheres with high-O2or high CO2concentrations on postharvest physiology and storability of ‘Napoleon’ sweet cherry[J].Acta Botanica Sinica,2002,44(8):925-930.

[8] Havir E A,Mchale N A.Biochemical and developmental characterization of multiple forms of catalase in tobacco leaves[J].Plant Physiology,1987,84(2):450-455.

[9] Latunde-Dada A O,Lucas J A.The plant defence activator acibenzolar-S-methyl primes cowpea seedlings for rapid induction of resistance[J].Physiological and Molecular Plant Pathology,2001,58(5):199-208.

[10] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京:高等教育出版社,2000.

[11] 鄒琦.植物生理學實驗指導[M].北京：中國農業出版社,2006.

[12] Ton J,Van Pelt J A,Van Loon L C,etal.Differential effectiveness of salicylate-dependent and jasmonate/ethylene-dependent induced resistance in Arabidopsis[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2002,15(1):27-34.

[13] Suzuki S,He Y.Indole-3-acetic acid production in Pseudomonas fluorescens HP72 and its association with suppression of creeping bentgrass brown patch[J].CurrentMicrobiology.2003,47(2)：0138-0143.

[14] Ryu C,Farag M,Hu C,etal.Bacterial volatiles induce systemic resistance in Arabidopsis[J].Plant Physiology,2004,134,1017-1026.

[15] Cortes-Barco A M,Hsiang T,Goodwin P H.Induced systemic resistance against three foliar diseases of Agrostisstoloniferaby (2R,3R)-Butanediol or an isoparaffin mixture.Annals of Applied Biology[J].Plant Pathology,2010,157:179-189.

[16] Hsiang T,Goodwin P H,Cortes-Barco A M.Plant defense activators and control of turfgrassdiseases[J].Outlooks on Pest Management,2011,22(4):160-164.

[17] 馬暉玲,房媛媛.植物抗病性及誘導抗病性在匍匐翦股穎病害防治中的應用[J].草業學報,2014,23(5):312-320.

[18] 馬祥,馬暉玲,安惠惠,等.誘導劑丁二醇對匍匐翦股穎抗病相關的防衛酶活性的影響[J].草原與草坪，2012,32(3):37-42.

[19] 房媛媛,馬暉玲.2,3-丁二醇與水楊酸誘導匍匐翦股穎對鐮刀菌枯萎病的抗性[J].草原與草坪,2015,35(3):83-87.

[20] 徐秉良,李敏權,郁繼華，等.苜蓿對白粉病的抗性與葉綠素含量的關系[J].草業科學,2005(4):72-74.

[21] 金珠,匡晶,洪法水,等.馬齒莧抗霜霉病的生理基礎研究[J].淮北煤師院學報(自然科學版),1999(3):55-59.

[22] Brennan T C.Involvement of hydrogen peroxide in the regulation of senescence in pear[J].Plant Physiol,1997,59(2):411-416.

[23] 代春艷,朱振家,安翠香,等.誘抗劑BTH誘導甜瓜幼苗抗白粉病相關酶活性的研究[J].江蘇農業學報,2010,26(2):286-291．

[24] 孫嘉曼,傅俊范,嚴雪瑞,等.相關防御酶對人參銹腐病誘導抗性的響應[J].植物病理學報,2012(4):396-403．

[25] 李堆淑,胡景江.寡聚糖激發子對楊樹防御酶系活性的影響[J].西北林學院學報,2012(2):26-29．

[26] 許晴晴,郜海燕,陳杭君.茉莉酸甲酯對藍莓貯藏品質及抗病相關酶活性的影響[J].核農學報,2014(7):1226-1231.

[27] 李波,祝一鳴,單體江,等.AXY22和苯并噻二唑的組合誘導對桉樹抗病相關酶活性和丙二醛的影響[J].中國森林病蟲,2016(6):1-5.