一種醬香風味紅茶的研制

楊久玲，謝 和，杜超峰

(1.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.藍茅生態農業有限公司，貴州 黔東南 557500)

紅茶是市場上的主銷茶類，2015年，中國紅茶的產量為25.8萬噸，較2014年增長了12.95%，其中內銷 15.84萬噸，占國內茶葉銷量的9%，出口2.8萬噸，占茶葉總出口量的8.7%[1]。為了滿足不同消費者的需求，更好的占有市場，一些廠商開始研發具有獨特風味的紅茶制品。目前，已經開發出的紅茶產品有各種花香型紅茶：如金銀花香型[2]、橘子花香型[3]、梔子花香型[4]紅茶等；果香型紅茶：如藍莓香型[5]紅茶；其他香型紅茶：如麥香型[6]、香草香型紅茶[7]等。醬香是我國傳統食品特有的一種香型，在食品、制醬、釀酒等方面都得到了廣泛的應用。如在釀酒方面，醬香型白酒茅臺酒被譽為國酒；以茅臺酒為原料生產的國酒香型卷煙也已上市銷售；在風味食品方面，利用芽孢桿菌發酵生產的醬香風味牛肉[8]等獲得了成功。因此，本實驗主要通過微生物發酵技術將醬香風味與紅茶的特有香味有機地結合起來，研制出一種新型的具有醬香風味的紅茶。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1發酵菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)E20菌株，由貴州大學生命科學學院微生物實驗室提供。

1.1.2主要培養基 牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂20 g/L，自來水1000 mL， pH7.2～7.4，121℃，0.1 Mpa，滅菌30 min。

種子培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，自來水1000 mL，pH7.2～7.4，121℃，0.1 Mpa，滅菌30 min。

發酵培養基：黃豆用水浸泡24 h，分裝三角瓶(100 g/500 mL)，121℃，0.1 Mpa，滅菌30 min。

1.1.3主要原料及試劑 紅茶：產地為貴州都勻。分析純試劑：磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、茚三酮、堿式乙酸鉛、濃鹽酸、濃硫酸、甲醇、福林酚、碳酸鈉、乙酸乙酯、乙醇、碳酸氫鈉、草酸。標準品：茶氨酸、茶多酚、咖啡堿。

1.1.4主要儀器與設備 DH 5000 型電熱恒溫培養箱(天津市泰斯特儀器有限公司)、ZWYR-D2403氣浴恒溫振蕩器(上海智成公司)、TG-W型微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)、SW-CJ-1FD型凈化工作臺(上海錦昱科學儀器有限公司)、XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋(浙江新豐醫療器械有限公司)、TY紫外分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1評分標準 以國家標準GB/T-23776-2009《茶葉感官審評方法》[9]、GB/T-14487-1993《茶葉感官審評術語》[10]為依據，對研制的醬香風味紅茶感官審評。醬香風味紅茶得分主要是由醬香風味紅茶香氣及滋味決定。

1.2.2發酵菌劑的制備 菌種活化：將E20菌株接種到牛肉膏蛋白胨固體培養基上，30℃培養24 h，重復2～3次，活化菌種。

擴大培養：挑取活化好菌種的單菌落接種至50 mL種子培養基，30℃、150 r/min搖床培養24 h，制取菌懸液。

發酵培養：在發酵培養基中接種2 mL菌懸液，程序升溫發酵6 d。

1.2.3單因素篩選試驗 在浸提時間12 h、發酵提取液添加量為20%、35℃干燥3 d的條件下，探究不同乙醇溶液濃度對醬香風味紅茶品質的影響。發酵培養基發酵完成后，加入100 mL濃度分別為0.0087、0.0095、0.0104、0.0113、0.0122、0.013 04 mol/L的乙醇溶液。對制得的醬香風味紅茶進行感官審評。

在乙醇溶液濃度為0.0104 mol/L、發酵提取液添加量為20%、35℃干燥3 d的條件下，探究不同浸提時間對醬香風味紅茶品質的影響。加入乙醇溶液，分別浸提6、12、24 h。4000 r/min離心20 min。對制得的醬香風味紅茶進行感官審評。

在浸提時間12 h、乙醇溶液濃度為0.0104 mol/L、35℃干燥3 d的條件下，探究不同發酵提取添加量液對醬香風味紅茶品質的影響。往紅茶中分別噴施重量體積比分別為10、15、20、25、30%的發酵提取液，充分混勻。對得到的醬香風味紅茶進行感官審評。

1.2.4醬香風味紅茶生產工藝的優化 以感官審評為標準，在單因素試驗的基礎上，參考《生物統計附實驗設計》[11]，運用SPSS 20.0設計正交表，對醬香風味紅茶的生產工藝進行優化，確定最優的生產工藝。

1.2.5醬香風味紅茶主要化學成分的測定 根據國家標準測定醬香風味紅茶的總游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素等主要化學成分。游離氨基酸總量：GB/T8314-2013《茶游離氨基酸總量的測定》[12]采用茚三酮比色法；茶多酚：GB/T8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素含量的檢測方法》[13]采用福林酚顯色法；咖啡堿：GB/T8312-2013《茶咖啡堿測定》[14]采用紫外分光光度法；茶色素：《茶葉生物化學》[15]采用紫外分光光度法。并對醬香風味紅茶主要化學成分含量與對照茶樣進行比較。

2 結果

2.1 乙醇溶液濃度

乙醇是良好的有機溶劑，能與水任意比互溶，且能食用，是本研究的最佳溶劑。往發酵完成的培養基中加入濃度分別為0.0087、0.0095、0.0104、0.0113、0.0122、0.013 04 mol/L的乙醇溶液提取醬香物質。

圖1 乙醇溶液濃度對醬香風味紅茶審評得分的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on soy sauce flavor Black Tea review score

圖1結果表明，當乙醇溶液為0.0087 mol/L時，制得的醬香風味紅茶得分較低，其香氣不純正，雜味在紅茶的香味中顯得突兀，影響醬香風味紅茶的品質。隨著乙醇溶液濃度的增加，醬香越濃郁，滋味越醇正，得分越高。且在濃度為0.0113 mol/L時，得分最高，其醬香濃郁，滋味醇厚，雜味最淡。乙醇溶液濃度超過0.0113 mol/L時，紅茶香氣中的雜味明顯增加。可能是因為乙醇溶液濃度為0.0113 mol/L時，呈雜味的物質溶解得較少。

2.2 浸提時間

浸提時間太短，不能將大部分呈醬香的物質提取出來，浸提時間過長，微生物會產生其他異味，導致醬香風味不純。因此，選擇合適的浸提時間尤為重要。將濃度為0.0104 mol/L的乙醇溶液溶液加入到黃豆發酵培養基，分別浸提6、12、24 h。

圖2結果顯示，浸提6 h時，得分較低，制得的紅茶醬香風味不足，滋味淡薄。浸提時間為12 h時，得分較高，有較濃郁的醬香風味，雜味淡，滋味平和。當浸提時間為24 h，感官評分最高，醬香濃郁，滋味較醇和，雜味淡。

2.3 發酵提取液添加量

往茶葉添加發酵提取液的量直接影響呈香的效果，若添加的量過少，茶葉則不能呈醬香或醬香不夠濃郁；發酵提取液添加量過多，茶葉除了呈現醬香風味外，還會呈現更多的雜味。往紅茶中分別加入10、15、20、25、30%的發酵提取液，充分混合。

圖2 浸提時間對醬香風味紅茶審評得分的影響Fig.2 Effect of extraction time on soy sauce flavor Black Tea reviewer score

圖3 發酵提取液添加量對醬香風味紅茶審評得分的影響Fig.3 The fermentation extract effect of the adding quantity of Maotai-flavor Black Tea review score

圖3結果顯示，發酵提取液的添加量在20%以前，醬香風味紅茶的醬香味不足，在添加量為10%時，甚至感受不到明顯的醬香味，因此感官評分較低。當發酵提取液的添加量超過20%，茶葉中除了濃郁的醬香味外，還會有豆豉味、酸味等其他雜味，感官評分得分也較低。當添加量為20%時，茶湯有濃郁的醬香風味，其他的雜味較淡，醬香味和紅茶的本味能夠很好的融合，使得整體滋味更加醇和。因此，當發酵提取液的添加量為20%時，感官評分最高。

2.4 醬香風味紅茶生產工藝的優化

在單因素試驗的基礎上，選用 L9(34)正交表進行實驗，所采用的因素和水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計Tab.1 The factors and the levels

優化結果見表2。

表2 醬香風味紅茶最佳生產工藝正交試驗設計Tab.2 Maotai-flavor of black tea best production process of orthogonal experimental design

表1顯示，三個因素為乙醇濃度、浸提時間、發酵提取液添加量；乙醇濃度0.0104、0.0113、0.0122 mol/L，浸提時間6、12、24 h，發酵提取液添加量15、20、25%。

表2中，根據R值的大小可以看出三個因素對醬香風味紅茶的影響存在顯著性的順序，A>C>B，即乙醇溶液濃度>發酵提取液添加量>浸提時間。醬香風味紅茶生產的最優條件是A2B2C2，乙醇溶液濃度為0.0113 mol/L、浸提時間為12 h、提取液的添加量為20%。

2.5 醬香風味紅茶主要化學成分的測定

根據國家標準測定對照茶樣、醬香風味紅茶、發酵提取液中的總游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素，并對醬香風味紅茶主要化學成分含量與對照茶樣進行比較，結果如下。

表3結果顯示，對照茶樣中內含物含量分別為：總游離氨基酸1.20%、茶多酚12.61%、咖啡堿2.13%、茶紅素4.72%、茶黃素0.62%、茶褐素6.97%；醬香風味紅茶中內含物含量分別為：總游離氨基酸2.83%、茶多酚12.62%、咖啡堿2.15%、茶紅素4.55%、茶黃素0.66%、茶褐素6.92%。運用獨立樣本T檢驗對對照茶樣及醬香風味紅茶的主要化學物質進行比較，表4發現：總游離氨基酸差異顯著，茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素差異不顯著。對發酵提取液的內含物檢測發現：總游離氨基酸含量為 8.82 mg/ml，茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素再發酵提取液中幾乎檢測不到。因此，醬香風味紅茶中部分游離氨基酸是發酵提取液中加入的，為茶湯的鮮爽滋味提供了物質基礎。

表3 主要化學成分含量(%，DW)Tab.3 Contents of main chemical components

表4 醬香風味紅茶與對照茶樣主要化學成分的獨立樣本T檢驗Tab.4 The independent sample T test of main chemical components with Maotai-flavor black tea and comparison of tea sample

注：“**”表示差異極顯著。

3 討 論

本研究以E20菌株為發酵菌種，黃豆為發酵原料，研制醬香風味紅茶，具體加工參數是：在100 g發酵培養基中接入2%的E20菌懸液，按程序升溫發酵6 d；將0.0113 mol/L的乙醇溶液100 mL加入到黃豆發酵培養基浸提12 h，4000 r/min離心20 min制得提取液；往紅茶中加入20%的發酵提取液，混勻；將茶葉置于35℃干燥箱3 d，即制得了醬香風味的紅茶制品。對對照茶樣及醬香風味紅茶的主要化學物質進行比較，兩者總游離氨基酸差異顯著，茶多酚、咖啡堿、茶紅素、茶黃素、茶褐素差異不顯著。說明醬香風味紅茶中部分游離氨基酸是由發酵提取液提供的。目前，在利用產醬香微生物開發醬香風味食品，主要是將產醬香風味的微生物接種到需要開發的材料上，如將大慶、謝和研發的風味牛肉[9]，就是將產醬香微生物直接接種到牛肉上，使牛肉發酵產生獨特的醬香風味。但是有的原料如茶葉，茶葉的內含物如茶多酚類物質具有廣譜的抑菌活性，對近百種細菌均有抑制作用[16-17]，且茶葉上營養寡淡，使得產醬香微生物不能在茶葉上正常生長并且產醬香。因此，要使這類原料產生醬香風味，可以通過先制取發酵提取液，然后噴施到原料上得方法來制取醬香風味食品。

[1] 梅 宇，王智超，林 璇.2015年中國茶葉產銷形勢分析[J]. 茶世界.2016(04)：21-30.

[2] 王曉春，姜 婭，張偉魯.一種金銀花香紅茶的制作方法[P]. 中華人民共和國國家知識產權局.CN 106173106 A.

[3] 涂國仙，張成仁.橘子花香型紅韻紅茶的制作方法及橘子花香型紅韻紅茶[P]. 中華人民共和國國家知識產權局.CN 106306176 A.

[4] 王曉春，姜 婭，張偉魯.一種梔子花花香紅茶的制作方法[P]. 中華人民共和國國家知識產權局.CN 106343049 A.

[5] 張新富，董 輝，張邵蘭.藍莓香型綠茶和藍莓紅茶的制備方法[P]. 中華人民共和國國家知識產權局.CN 103609769 A.

[6] 付代豪.一種麥香紅茶的加工方法[P]. 中華人民共和國國家知識產權局.CN 104719517 A.

[7] 涂建華.細梗香草紅茶配方及其制作方法[P]. 中華人民共和國國家知識產權局.CN 105746821 A.

[8] 將大慶，謝 和.GZJSI-2芽孢桿菌在風味牛肉制作中的應用[J]. 廣東農業科學.2015(10)：94-99.

[9] 茶葉感官審評方法[S]. GBT 23776-2009.

[10] 茶葉感官審評術語[S]. GBT 14487-1993.

[11] 明道緒.生物統計附實驗設計[M]. 中國農業出版社.2007：248-262.

[12] 茶游離氨基酸總量的測定[S]. GBT 8314-2013.

[13] 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法[S]. GBT 8313-2008.

[14] 茶咖啡堿測定[S]. GBT 831-2013.

[15] 宛曉春.茶葉生物化學(第三版)[M]. 中國農業出版社， 2003：173-215，34，199-205.

[16] Friedman M.Overview of antibacterial，antitoxin，antiviral，and antifungal activities of tea fl avonoids and teas [J].MolNutrFoodRes， 2007， 51(1)： 116-134.

[17] Kumar A， Kuma A， Thaku P，etal.Antibacterial activity of green Tea (Camellia sinensis)extracts against various acteria isolated from environmental sources [J].RecentResSciTechnol， 2012， 4(1)：19-23.