用于傳統書畫修復的不同加熱溫度豆漿水中大豆蛋白的疏水性分析

何秋菊 王麗琴

摘 要 豆漿水是中國傳統書畫修復中的施膠材料，加熱可導致大豆蛋白產生熱變性，使紙張產生不同程度的疏水性，從而影響到書畫修復的效果。本研究利用8-苯胺基-1-萘磺酸（ANS）熒光探針法分析大豆蛋白在加熱過程中疏水性的變化； 利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析加熱前后的蛋白質差異條帶，并以液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）進行蛋白鑒別； 衰減全反射傅里葉變換紅外光譜法（ATR-FTIR）去卷積、二階導數曲線擬合分析不同加熱溫度豆漿水大豆蛋白二級結構的變化。ANS熒光探針實驗結果表明，80℃的豆漿水的疏水性最大。SDS-PAGE與LC-MS/MS分析表明，加熱消失的兩個條帶的蛋白分別為球蛋白Glycinin G3亞基及糖蛋白凝集素Lectin亞基； ATR-FTIR分析表明，隨著溫度從25℃上升到80℃，大豆蛋白β-片層結構含量由41.14%增加到48.87%，α-螺旋、 β-轉角和無規卷曲結構向β-片層結構轉變，而β-片層結構含量與表面疏水性呈正相關，加熱溫度為80℃的豆漿水最適于書畫修復。

關鍵詞 豆漿水； 加熱溫度； 宣紙； 大豆蛋白； 疏水性

1 引 言

古書畫修復是一種搶救、保護古舊殘損書畫作品的傳統技藝。豆漿水作為天然植物蛋白膠結物用作書畫修復用紙絹的施膠材料，以提高紙絹遇水的穩定性，避免書畫在全色、接筆修復中顏色被暈開[1]。豆漿水中的大豆蛋白大部分是球形蛋白，帶負電的谷氨酸和羥脯氨酸較多，具有一定的疏水性[2]，可使紙張產生抗水性。加熱會破壞蛋白分子的天然結構，導致其熱變性以及其它理化性質的變化[3]，如蛋白質溶解度下降[4]，蛋白結構從聚合到展開狀態，疏水區域暴露[5]。不同熟度的豆漿水會導致紙張產生不同程度的疏水效果，從而影響到修復效果。目前，在文物保護修復領域尚未見對不同加熱溫度豆漿水的疏水性研究報道。

ANS熒光探針是一種陰離子型探測劑，與蛋白質的疏水區域結合后，熒光強度明顯增強，通過測定其熒光強度變化可表征蛋白質疏水性的強弱[6，7]。Alizadeh-Pasdar等[8]采用ANS熒光探針測定乳清蛋白分離物、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白在80℃加熱前后不同pH值時的表面疏水性，研究結果表明，體系pH值大小會影響蛋白質表面疏水性強弱。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法是依據蛋白質分子量的差異進行分離，借助凝膠成像分析系統記錄特征條帶的光密度，實現了蛋白組份及其亞基的定性定量測定[9]。黃惠華等[10]采用SDS-PAGE法在大豆脫脂豆粕、“堿提酸沉”和“超濾法”分離蛋白中分離出17種蛋白組分，發現大豆水浸提液經高溫處理后，對熱敏感的譜帶解聚消失。衰減全反射傅里葉變換紅外光譜法（ATR-FTIR）結合傅里葉去卷積和二階導分峰、光譜擬合可定量測定蛋白質二級結構[11]。Muragama等[12]利用FTIR研究了牛血清白蛋白熱變性過程中二級結構的變化，研究結果表明，隨著溫度升高，α-螺旋含量逐漸降低，β-轉角和分子間β-片層等含量逐漸增加。

本研究將ANS熒光探針法及SDS-PAGE凝膠電泳法等方法應用于文物修復研究中，研究了不同熟度豆漿水大豆蛋白表面疏水性、加熱前后大豆蛋白亞基及二級結構的變化，確定了書畫修復用豆漿水的適宜加熱溫度，為豆漿水在紙質文物保護修復中的科學使用和機理研究提供依據。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

POLARstar Omega 多功能酶標儀（德國BMG Labtech公司）； DJ12B-A10豆漿機（九陽公司）； GE Hoefer Mini VE垂直電泳系統（美國GE公司）； Dionex Ultimate 3000 液相色譜系統、LTQ-Orbitrap Velos pro質譜儀（美國Thermo公司）； Alpha便攜式傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker公司）。

大豆（市售黃豆）； Na2HPO4、NaH2PO4、十二烷基硫酸鈉 （SDS ）、異丙醇（分析純，西隴化工公司）； ANS（分析純，美國Sigma公司）； Tris-HCl緩沖溶液、考馬斯亮藍R-250（上海生工公司）； 甘氨酸（美國Amersco公司，BR）； 蛋白Marker（10～180 kDa，美國Thermo Scientific公司）； 二硫蘇糖醇、甘油、溴酚藍、乙醇、冰醋酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）； 乙腈、甲醇、甲酸（質譜級，德國Merck公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 不同熟度豆漿水的制備 稱取適量黃豆于25℃浸泡12h ，采用豆漿機果汁功能打散攪拌20 min后，用過濾網濾掉殘渣，制得大豆含量分別為3%和10%（w/V）的生豆漿水。將生豆漿水在水浴鍋中分別加熱至50℃、80℃、95℃，并保溫20 min，然后過濾去渣，得到不同熟度的豆漿水，冷卻至室溫，備用。

2.2.2 ANS熒光探針分析 分別量取10 mL上述制備好的3% （w/V）不同熟度的豆漿水加入于50 mL 0.01 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液（PB，pH 7.0）中，室溫攪拌20 min，用高速均質機均質2 min， 10000 r/min離心30 min。采用Bradford法[13，14]測定不同熟度豆漿水溶液中大豆蛋白濃度，然后用0.01 mol/L PB將上述離心后的上清液分別稀釋至蛋白濃度為0.03～1.50 mg/mL。取稀釋后的樣品溶液2 mL，分別加入50 mmol/L ANS溶液16 μL，振蕩后靜置3 min，利用多功能酶標儀測定樣品的熒光強度（FI）。使用ANS作為外源熒光探針測定溶解于PB溶液中蛋白質的表面疏水性[15]，激發波長（λex）為355 nm，發射波長（λem）為520 nm，狹縫寬度為5 nm。以FI對蛋白質濃度作圖，初始段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數S0。

2.2.3 SDS-PAGE分析 將上樣緩沖液（200 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L 二硫蘇糖醇，8% （w/V）SDS，0.2%溴酚藍，20%甘油）分別與10% （w/V）不同熟度的豆漿水以體積比1∶3混合。樣品和蛋白標準品點樣電泳的上樣量分別為10 μL和3 μL。電泳緩沖液為250 mmol/L Tris-HCl、2.5 mol/L甘氨酸、1% SDS。濃縮膠上施加電壓140 V，電泳時間30 min。當染料前沿進入分離膠后，將電壓提高至160 V， 約90 min后，待溴酚藍電泳出膠槽即停止電泳。取出凝膠，用考馬斯亮藍染色液（0.1%（w/V）考馬斯亮藍R-250，25%（V/V）異丙醇，10%（V/V）冰醋酸）染色，脫色液（150 mL乙醇，50 mL冰醋酸，300 mL超純水）脫色至電泳帶清晰，以凝膠成像系統成像并采集數據。

2.2.4 液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）分析 從SDS-PAGE電泳凝膠中切取分辨較好、加熱后有差異的蛋白質條帶進行LC-MS/MS檢測。方法如下：將差異條帶切碎并置于1.5 mL 離心管中，對染色的蛋白質條帶按照質譜制樣的要求，進行脫色、還原、烷基化、酶解、萃取和脫鹽等處理[16]。經離心濃縮干燥后，用0.1%（V/V）甲酸溶液復溶，高速離心后，取10 μL上清液進行LC-MS/MS分析。HPLC分析使用C18毛細管柱（200 mm×75 μm，5 μm），流動相A為0.1%（V/V）甲酸，流動相B為80%（V/V）乙腈-0.1%（V/V）甲酸，梯度洗脫程序： 0～5 min，98% A； 5～43 min，95% A； 43～52 min，80% A； 52～54 min， 65% A； 54～60 min，100% B。流速0.30 μL/min。質譜分析采用ESI源，正離子掃描方式，一級質譜掃描范圍m/z 400～1500，在35%歸一化碰撞能（CID）下，選擇一級圖譜中峰強度最高的20個峰在離子阱中進行相關MS/MS掃描。搜庫軟件Thermo proteome discover 2.1，在uniprot-soybean.fasta（http：//www.uniprot.org/）大豆庫中搜索MS/MS譜對應蛋白。固定修飾：烷基化（C）； 可變修飾：氧化（M）； 反庫搜索； 酶：胰酶； 最大漏切位點數：2； 一級質量偏差：10 ppm； 二級質量偏差：0.02 Da。

2.2.5 ATR-FTIR分析 在載玻片上制備不同加熱溫度的豆漿水膜，待干后揭下，用于ATR-FTIR分析。檢測范圍540～4000 cm1，分辨率4 cm1，波數精度0.01 cm1，掃描次數64次，溫度25℃。利用OMNIC8.2軟件對紅外光譜圖進行歸一化處理，以消除樣品用量對紅外光譜強度的影響。對酰胺Ⅰ帶（1700～1600 cm1）進行去卷積處理，半峰寬為10 cm1，增強因子為2.0。用Peak fitv4.12對去卷積光譜進行二階導數分峰擬合。多次擬合使殘差最小（r2≥0.96），確定各子峰與二級結構的對應關系后，根據其積分面積計算各種二級結構的相對百分含量。

3 結果與討論

3.1 ANS熒光探針分析

圖1為采用ANS 熒光探針分析不同熟度豆漿水中大豆蛋白樣品表面疏水性指數S0的結果。隨著加熱溫度的升高，大豆蛋白的S0值呈上升趨勢； 80℃時S0值最大，疏水性最強； 但當溫度高于80℃時，S0值略有降低，表面疏水性呈下降趨勢。據報道，蛋白質表面疏水性與空間構象、氨基酸及亞基組成密切相關[17]，因此，以下實驗分別從大豆亞基組成和二級結構兩方面研究其對表面疏水性的影響。

3.2 SDS-PAGE電泳法聯用LC-MS/MS分析

經過SDS-PAGE電泳分離和考馬斯亮藍染色所得的豆漿水分析結果如圖2所示。結果表明，加熱至80℃時，豆漿水中分子量約在55和35 kD處的兩個蛋白條帶消失（圖2方框所示）。這兩個條帶經胰酶酶解后，利用LC-MS/MS分析，在Uniprot大豆庫中搜索，結果如表1所示，每個差異條帶經分析篩選后，共得到3種潛在的蛋白。其中，加熱后消失的55 kD處的條帶1潛在蛋白為大豆球蛋白的一種亞基，分值最高的為球蛋白Glycinin G3亞基。消失的35 kD處的條帶2潛在蛋白分值最高的為糖蛋白凝集素Lectin亞基。結果表明， 加熱溫度超過80℃后，大豆蛋白可能發生熱變性，導致沉淀。

3.3 ATR-FTIR分析

不同加熱溫度下豆漿水的紅外光譜見圖3。1600～1700 cm1處的酰胺Ⅰ帶C=O伸縮振動是計算蛋白二級結構的主要譜帶[18]，其中1610～1640 cm1對應β-片層，1640～1650 cm1為無規卷曲，1650～1660 cm1為α-螺旋，1660～1700 cm1為β-轉角[19]，通過對酰胺Ⅰ帶傅里葉去卷積和二階導分峰擬合可得到蛋白質二級結構相對變化（圖4）。

由圖4可知，不同加熱溫度的豆漿水中的大豆蛋白質二級結構發生了改變，通過計算各子峰積分面積得到二級結構定量信息（表2）。由表2可見，隨著加熱溫度由25℃上升到80℃，β-片層結構相對含量由41.14%增至48.87%，溫度至90℃后減少為45.43%； 相對應的α-螺旋、 β-轉角和無規卷曲結構的相對含量先減小再增加，說明隨著加熱溫度從25℃上升到80℃，蛋白質中α-螺旋、 β-轉角和無規卷曲向β-片層結構轉化。結合3.1節ANS熒光探針分析結果，80℃加熱的豆漿水的疏水性最大。本研究結果表明，大豆蛋白中，β-片層結構含量與表面疏水性呈現正相關，此結論與文獻[20，21]的研究結果一致。產生的原因可能是蛋白質分子β-片層含量較高時，分子結構相對松散，蛋白質分子內部“埋藏”的酪氨酸和色氨酸殘基的疏水性位點的暴露程度較大，表現出更強的表面疏水性。

4 結 論

研究了書畫修復中宣紙施膠用不同加熱溫度豆漿水大豆蛋白的疏水性，初步探討了疏水性變化機理。結果表明，隨著加熱溫度從25℃上升到80℃，大豆蛋白β-片層結構由41.14%增加到48.87%，α-螺旋、 β-轉角和無規卷曲結構向β-片層結構轉變， β-片層結構含量與表面疏水性呈現正相關，80℃的豆漿水的疏水性最大，因此最適用于書畫修復。

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