基于Aβ_25—35誘導的PC12細胞損傷模型研究定志小丸治療阿爾茲海默病的作用機制及配伍機制

鄭妍 劉舒 宋鳳瑞 劉志強

摘 要 利用β-淀粉樣蛋白片段Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷模型，從細胞凋亡及氧化應激兩個通路研究定志小丸對Aβ25-35引起的PC12神經細胞損傷的保護作用，并將定志小丸拆方為單味藥及三味藥， 用以闡明定志小丸治療阿爾茲海默病的作用機制、配伍機制以及主要活性藥味。通過MTT和乳酸脫氫酶含量測定評估定志小丸及各味藥對PC12細胞活力的影響，其中人參、茯苓效果最好，與模型組相比，可使細胞活力提高約30%。通過細胞凋亡、線粒體膜電位（MMP）、丙二醛（MDA）及還原型谷胱甘肽（GSH）含量測定，進一步從細胞凋亡及氧化應激兩個通路研究定志小丸及各味藥對Aβ25-35誘導PC12細胞保護作用，研究結果表明，人參、茯苓效果最優，不僅可以顯著抑制細胞凋亡，還可降低丙二醛（MDA）含量，減少膜脂過氧化； 遠志、石菖蒲可以通過提高細胞內還原型谷胱甘肽（GSH）含量進而抑制氧化應激損傷，且與人參、茯苓配伍后，可促進主要成分發揮藥效，顯著提高人參、茯苓的藥效。人參、茯苓是定志小丸中的主要活性藥味，遠志、石菖蒲起輔助增強藥效的作用。

關鍵詞 定志小丸； 拆方； 配伍作用； Aβ25-35； PC12細胞； 細胞凋亡； 氧化應激

1 引 言

阿爾茨海默病（AD）是一種以認知能力喪失為特征的神經退行性疾病，主要表現為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、人格改變以及語言障礙。由于缺乏有效的治療藥物，使得AD對患者及其家人都是一種毀滅性的疾病[1]。目前，AD的發病機制仍不十分明確，β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積形成老年斑后，誘導神經元氧化應激導致神經細胞損傷甚至死亡，進而導致認知功能進行性退化，是目前公認的主要發病機制之一[2，3]。因此，大量研究致力于篩選抗氧化劑和抗凋亡藥物作為潛在的AD治療藥物[4～9]。

中藥復方雖然成分復雜，但可以通過多成分作用于疾病相關的多個靶點而發揮協同治療作用，效果好且副作用較少，這與現代藥物集中單一靶點治療疾病不同。越來越多的學者致力于研究中藥對于AD的預防以及治療作用[4，10～15]。定志小丸（DZXW），源于唐代孫思邈的《備急千金要方》，由人參（GR）、茯苓（P）、遠志（PR）和石菖蒲（ATR）四味藥按照質量比3∶3∶2∶2 的比例組成，人參為“君藥”，茯苓為“臣藥”，遠志和石菖蒲為“佐藥”，已在臨床上應用多年，主要用于治療抑郁癥、焦慮癥、神經衰弱、阿爾茨海默病及帕金森病等病癥[16～18]。之前的研究已經確定了定志小丸中的64種主要活性成分，包括人參皂苷、三萜類化合物、遠志皂苷、寡糖酯、蔗糖酯、山酮糖苷等[19]。在藥理學研究方面，目前大部分研究都集中于人參、遠志單味藥或某一種有效成分對于AD的治療作用[20～23]，定志小丸的作用機制及配伍機制尚不明確[24]。為了評價藥物對AD的潛在治療效果，目前已建立了多種細胞模型用以研究藥物對神經細胞的保護作用，常用細胞模型有研究腦源性神經營養因子作用所使用的轉染SH-SY5Y細胞系[10，25～27]，以及研究Aβ蛋白沉積導致細胞毒性和神經元損傷所使用的Aβ誘導的PC12細胞損傷模型[3，15，20，21，28，29]，其中Aβ誘導的PC12損傷模型是目前應用最為廣泛的AD治療藥物體外活性評價模型。Aβ聚集后可以通過氧化應激、細胞凋亡等多種機制造成AD患者神經元大量丟失和突觸損傷[30]，在AD的發病過程中起關鍵作用。大量研究通過考察PC12細胞在Aβ蛋白介導下的氧化應激及細胞凋亡通路的變化考察藥物對AD的治療效果，如通過加入花青素可以顯著提高PC12細胞抗氧化應激能力[7]，加入淫羊藿素后可以抑制細胞凋亡、減少LDH泄露及線粒體膜電位的降低[31]。

本研究使用Aβ蛋白誘導的PC12細胞損傷模型研究定志小丸對神經細胞損傷的保護作用，選擇Aβ蛋白中毒性最強的Aβ25-35活性片段[32]。考察了定志小丸在細胞凋亡和氧化應激兩種機制下對PC12細胞的保護作用，其中細胞凋亡通路主要通過MTT實驗、LDH漏出量測定、流式細胞儀檢測細胞凋亡（ANNEXIN V-FITC/PI雙染色法及線粒體膜電位）等方面進行檢測； 氧化應激通路主要檢測與氧化應激反應密切相關的抗氧化劑還原型谷胱甘肽（GSH）及膜脂過氧化的重要產物丙二醛（MDA）的含量變化。為了闡明定志小丸的作用機制、配伍機制及主要活性藥味，除定志小丸外，還將其拆方成單味藥GR、P、PR、ATR及三味藥GR+P+PR、GR+P+ATR、GR+PR+ATR、P+PR+ATR，通過比較在細胞凋亡及氧化應激通路上對PC12細胞的保護作用的差異，闡明定志小丸配伍的科學合理性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

BDAccuri C6流式細胞儀（美國BD Biosciences公司）； Milli-Q超純水處理系統（美國Milford公司）； AL104 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）； MCO175型二氧化碳培養箱（日本Sanyo公司）； SpectraMax i3型酶標儀（美國Molecular Devices公司）； Allegra X-30R型離心機（美國Beckman公司）。

茯苓、遠志、石菖蒲均購自河北凱達公司； 人參購自吉林撫松； 所有中草藥均由吉林省中醫藥科學院黃青教授鑒定。Aβ25-35（Sigma-Aldrich公司，貨號A4559，Mw=1060.26，白色固體粉末）； DMEM高糖培養基（HyClone公司）； 胎牛血清（BI公司）； 噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich公司）； 大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞株（中國科學院上海細胞庫）。考馬斯亮藍（50T）、丙二醛試劑盒（50T）、乳酸脫氫酶試劑盒（96T）和還原型谷胱甘肽試劑盒（96T）均購自南京建成公司； ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（50T，Solarbio公司）； 羅丹明123（1 mg/mL，北京鼎國公司）。

2.2 中藥提取物制備

提取方法參考文獻[33]，取50 g的定志小丸用75%乙醇回流提取2次，每次提取時間為2 h，提取液為生藥量的8倍。合并兩次提取液，過濾、減壓濃縮至50 mL，得到定志小丸質量濃度即生藥量為1 g/mL 的提取液。拆方后的單藥和三味藥的提取方法與定志小丸提取方法相同。

2.3 Aβ25-35老化處理

參照文獻[34]的方法，將Aβ25-35用高壓滅菌PBS（KH2PO4-NaHPO4，10 mmol/L， pH=7.2）緩沖鹽溶液配制成濃度為1 mmol/L的溶液， 37℃孵育72 h，使用時用高壓滅菌PBS緩沖鹽溶液稀釋為20 μmol/L[35]。

2.4 PC12細胞培養及MTT檢測細胞活力

PC12細胞培養于含10%（V/V）胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培養基中，并加入1% 青霉素-鏈霉素溶液。在含有5% CO2、37℃、飽和濕度的培養箱中培養。隔天換液，2～3天傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。使用MTT法檢測細胞活力，實驗分4組： 空白組、對照組、Aβ25-35模型組及Aβ25-35和中藥提取液共同作用組。將PC12細胞以4 × 103 /孔的密度種于96孔板上，培養24 h后，共同作用組將培養基替換為100 μL含10% FBS的DMEM培養基溶解的不同濃度的中藥提取物溶液，繼續培養24 h，其它3組更換新鮮培養液繼續培養24 h。隨后加入Aβ25-35誘導損傷24 h，其中對照組只更換培養液， 不加入Aβ25-35。棄去培養液，加入100 μL 1 mg/mL MTT孵育4 h后，去除MTT溶液， 并加入150 μL DMSO振蕩10 min。使用酶標儀檢測570 nm波長下的吸光度值，計算細胞存活率（Survival rate， SR）。

2.5 ANNEXIN V-FITC/PI檢測細胞凋亡

PC12細胞接種于6孔板，使用藥物及Aβ25-35干預后，收集各組細胞，使用冰PBS清洗兩次。使用試劑盒內緩沖鹽懸浮細胞，300×g離心10 min，再用緩沖鹽重懸細胞，將細胞稀釋至1×106 個/mL。每管加入100 μL細胞及5 μL Annexin V-FITC，室溫下避光混勻10 min后，再加入5 μL PI室溫避光孵育5 min。 加入PBS至500 μL，輕輕搖勻，孔徑75 μm （200目）尼龍網過濾，使用流式細胞儀檢測： FITC： 激發波長488 nm，發射波長530 nm； PI： 激發波長535 nm，發射波長615 nm。

2.6 線粒體膜電位（MMP）檢測

將PC12細胞接種于6孔板，使用藥物及Aβ25-35干預后，收集各組細胞（約1×106個/mL），使用預熱的PBS緩沖液洗滌兩次，將羅丹明123加入至細胞懸液。37℃下孵育30 min，粒徑75 μm（200目）尼龍網過濾后， 使用流式細胞儀分析，激發波長488 nm， 發射波長530 nm。

2.7 乳酸脫氫酶（LDH）含量測定

使用LDH測定試劑盒，通過受損細胞釋放到培養液中的LDH定量測定PC12細胞的損傷。經藥物和Aβ25-35處理后，收集各組細胞培養上清液，根據試劑盒測定方法處理樣品，使用酶標儀測定450 nm吸光度值，使用RIPA細胞裂解液裂解細胞，高速離心后， 使用BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度。

2.8 還原型谷胱甘肽（GSH）含量測定

將細胞接種于96孔板，使用藥物及Aβ25-35干預后，用冰PBS清洗2次，使用RIPA細胞裂解液裂解細胞，高速離心后， 使用BCA蛋白定量試劑盒定量分析蛋白濃度，GSH含量用試劑盒測定。

2.9 丙二醛（MDA）含量測定

將PC12細胞接種于6孔板，干預結束后使用冰PBS清洗2次，使用RIPA裂解細胞，離心取上清液，先進行蛋白定量分析，使用MDA試劑盒測定MDA含量。

2.10 統計學分析

實驗數據經SPSS 18.0軟件進行統計分析，所有數據以均數（x）±標準差（s）表示，采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，p<0.05認為具有統計學差異。

3 結果與討論

3.1 定志小丸、拆方后單藥、三味藥及Aβ25-35對PC12的細胞毒性

由表1可知，生藥量為1 mg/mL的9種中藥提取物作用于PC12細胞48 h后，細胞活力與對照組并沒有顯著性差異，在此濃度下，藥物對于細胞并無毒性，因此選取1 mg/mL生藥量作為后續實驗的加藥濃度。

3.2 定志小丸及拆方后單藥、三味藥對Aβ25-35誘導的PC12細胞毒性的抑制作用

圖1所示，與對照組相比，模型組Aβ25-35誘導的PC12細胞的活力明顯下降，說明20 μmol/L Aβ25-35對PC12細胞有明顯的毒性，加入1 mg/mL的不同中藥提取物后，PC12細胞活力顯著增加，其中人參、茯苓效果最為明顯。

3.3 定志小丸及拆方后的各味藥對Aβ25-35誘導的PC12細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC可與磷脂酰絲氨酸（Phasphatidylserine，PS）特異性結合。在細胞凋亡早期，細胞膜失去對稱性，PS暴露于細胞膜外，可被Annexin V-FITC結合， 從而成為識別細胞凋亡的標志。但是壞死細胞的PS同樣外路露于細胞膜外，因此加入碘化吡啶（PI）以區分壞死細胞。凋亡早期細胞膜仍保持完整性，PI不能進入細胞內，而處于凋亡晚期和壞死的細胞可同時被Annexin V-FITC/PI著色，可以準確反映凋亡過程。流式細胞儀Annexin V-FITC雙染法檢測結果顯示，PC12細胞在培養或處理過程中有自發凋亡的現象，但凋亡率較低（圖2A），經20 μmol/L Aβ25-35處理24 h后，凋亡細胞顯著增加，凋亡率達到71.4%（圖2B）。經單味藥人參、茯苓（圖2C、D）處理后，細胞凋亡率顯著降低，說明這兩味藥在抑制Aβ25-35損傷時起主要作用。

3.4 ANNEXIN V-FITC/PI法觀察細胞凋亡的形態學變化

采用ANNEXIN V-FITC/PI雙染色法研究細胞凋亡變化和細胞損傷。該方法可將早、中、晚期及死細胞區分開來。正常的活細胞，ANNEXIN V-FITC和PI均為低染，不著色； 細胞凋亡早期，ANNEXIN V-FITC高染， 細胞膜呈現綠色熒光，PI低染，細胞核不著色； 細胞凋亡中、晚期，ANNEXIN V-FITC和PI均高染，細胞膜呈現綠色熒光，細胞核呈現紅色熒光[36]。如圖3所示，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，對照組（圖3A）所選區域無明顯細胞異常且無凋亡細胞，模型組（圖3B）中PC12細胞顯示出核聚集，細胞突起回縮，PI染色發出紅色熒光。經定志小丸提取物處理后的細胞（圖3C-3K）其細胞凋亡發生了顯著的改善。其中，經人參、茯苓和定志小丸處理過的細胞變化尤為明顯，無凋亡晚期細胞，且細胞形態與健康細胞并無明顯差異。

3.5 定志小丸及各味藥抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞線粒體膜電位的下降

線粒體膜電位（MMP）在啟動線粒體介導的凋亡途徑中起關鍵作用。MMP降低是細胞凋亡早期的重要特征之一[37]。如圖4A所示，與對照組相比，加入Aβ25-35作用24 h后，MMP顯著降低，PC12細胞經中藥提取物處理后再加入20 μmol/L Aβ25-35作用24 h，MMP均有顯著升高。說明定志小丸及拆方后的各味藥均能抑制Aβ25-35帶來的MMP降低，其中人參、茯苓單味藥效果最為顯著。

3.6 定志小丸及各味藥對Aβ25-35誘導的PC12細胞中LDH釋放的影響

當PC12細胞處于氧化應激狀態下時，細胞處于易損狀態，LDH漏出率會明顯增加[38]。LDH水平越高，說明其細胞損傷越嚴重。如圖4B所示，模型組LDH漏出率高出對照組70%，經定志小丸及拆方后各味藥保護后，均可以顯著抑制LDH漏出，其中人參、茯苓單味藥效果最好，抑制漏出率可達40%以上。

3.7 定志小丸及各味藥對Aβ25-35誘導的PC12細胞內MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的重要產物，其含量高低可以作為考察細胞受損程度的指標之一，MDA的主要危害是導致膜脂過氧化，損傷生物膜結構，使得細胞膜結構和功能受到損傷，改變膜的通透性，從而影響一系列生理生化反應的正常進行[39]。如圖4C所示，模型組與對照組相比，MDA含量顯著升高，說明Aβ25-35可以造成細胞膜脂質過氧化，經定志小丸及拆方后各味藥保護后，MDA含量有不同程度降低，其中人參、茯苓單味藥效果最好。

3.8 定志小丸及各味藥對Aβ25-35誘導的PC12細胞GSH含量的影響

GSH是細胞內主要的非蛋白巰基化合物，是細胞中含量很高的一種抗氧化劑，其含量的微小變化就可以影響細胞的氧化還原平衡，因此在保護細胞抵抗氧化應激方面具有重要的作用[40，41]。經定志小丸提取物作用后的PC12細胞中GSH含量均顯著性增加，其中遠志、石菖蒲單藥作用效果最好（圖4D）。

4 結 論

本研究構建了Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷模型，從細胞凋亡和氧化應激兩個角度對定志小丸治療AD的作用機制及配伍機制進行了研究。通過比較定志小丸及其對應的單味藥及三味藥在細胞凋亡及氧化應激通路上對PC12細胞保護作用的差異，闡明了定志小丸配伍的科學合理性： 人參、茯苓在維持細胞活力方面發揮主要作用，同時可以顯著降低MDA含量，減少氧化應激損傷，是定志小丸中的主要活性藥味； 遠志、石菖蒲可促進GSH增加，主要通過中藥配伍后的協同作用促進人參與茯苓兩味藥的治療效果。本研究結果表明，Aβ25-35誘導的PC12細胞損傷模型，是一種簡單、穩定、實驗周期短的細胞模型，不僅可以用于評價藥物治療AD的療效和研究其作用機制，并且還可以用于闡釋復方中藥的配伍機制。

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