皮膚外用制劑生物利用度及生物等效性研究進展

吳黎莉 陳 沄

皮膚靶部位藥物濃度的動態變化過程對皮膚外用制劑的有效性和安全性評價具有重要價值。目前FDA對皮膚外用制劑的生物利用度要求取決于制劑的藥理學分類。除了糖皮質激素類建議采用血管收縮測定法外，其他皮膚外用制劑的生物等效性評價還主要通過仿制藥和創新藥的臨床對比試驗進行，往往需要數百名參與者，既費時且費用昂貴。其他研究方法如膠帶粘貼法、皮膚微透析、開流微量灌注及體外研究方法等的研究與應用日益廣泛，有望成為皮膚外用制劑生物利用度和生物度研究的可行性手段。

1 FDA 認可的生物等效性研究方法

1.1 臨床終點生物等效性研究 是目前評價局部用藥品的生物等效性的最為常用的方法。該方法是根據在患者中證明安全性和有效性等效，確定兩種制劑生物等效。臨床終點生物等效性研究使用美國FDA推薦的藥品專屬性指標。如果參比藥品標簽上有多種適應癥，那么通常將對藥物局部遞藥最為敏感的適應癥作為首選。

1.2 McKenzie-Stoughton血管收縮測定法(Vasoconstrictor Assay, VCA) 也被稱為人體蒼白斑試驗(human skin blanching assay, HSBA)，是目前FDA認可的唯一的體內藥效學方法[1]。該方法僅限于糖皮質激素類藥物，其原理是基于局部外用糖皮質激素藥物后，皮膚微血管收縮，產生可見的蒼白反應，其程度直接與藥物的臨床療效相關。蒼白程度可以通過比色計、數字圖像分析以及肉眼觀察等方法進行測量。由于比色計測量的可靠性和重現性，目前管理部門將其作為首選。1995年，美國FDA發布了《行業指南：皮膚外用皮質類固醇：體內生物等效性》[2]。

Greive等[3]采用VCA法考察了受試制劑0.1%糠酸莫米松水凝膠相對于參比制劑0.1%糠酸莫米松洗液的生物等效性。90名健康受試者(男女兼有)于前臂屈側局部外用受試制劑和參比制劑(5 mg/cm2)30 min后去除藥物，等待30 min后采用比色計測量去除藥物后0, 2, 4, 6, 19, 24 h皮膚的血管收縮反應，比較兩制劑效應曲線下面積(AUEC0-24)，結果表明兩制劑生物等效。

Krishna等[4]考察了改進后的具有乳化體系的糠酸莫米松乳膏多次給藥后的局部安全性和耐受性，并采用VCA法評價其單次給藥后相對于已上市的糠酸莫米松乳膏的生物等效性。結果表明42名健康受試者上背部連續給藥21天，新乳膏及其基質均無皮膚刺激性反應。105名健康受試者前臂屈側局部外用受試和參比制劑后效應曲線下面積比值為112.91%，范圍為105.55%～120.87%，兩制劑生物等效。

2 其他研究方法

2.1 膠帶粘貼法(Tape stripping method) 也被稱為皮膚藥代動力學方法(Dermatopharmacokinetic method, DPK)，是在局部用藥及去除藥物后的特定時間內，采用膠帶連續剝離角質層，從而獲得藥物在角質層中的濃度數據[5-7]。該方法假設：1)角質層是藥物局部吸收的限速屏障；2)角質層中藥物濃度與其下的表皮層中的藥物濃度直接相關[7,8]。該方法相對無痛、基本無創，被廣泛用于與角質層相關的研究中。

1998年，美國FDA發布了指南草案《皮膚局部用藥品新藥申請和仿制藥品申請的體內生物利用度、生物等效性、體外釋放和相關研究》[9]。在該指南中，DPK方法被推薦用于皮膚局部用藥品的生物等效性評價。該指南于2002年5月基于以下原因被撤回[6,10,11]：1)DPK方法不足以評價所有皮膚外用制劑的生物等效性，因為它們可以用來治療不同皮膚部位的多種疾病。對于非角質層作用靶位以及滲透機制不同于角質層擴散(如濾泡吸收等)的藥物，并不能反映其治療有效性；并且DPK方法不適用于疾病狀態;2)方法在不同實驗室之間的重現性問題。

由于人體皮膚角質層厚度存在個體差異，因此按照FDA指南草案中的規定，對不同受試者采用相同層數膠帶，粘取的角質層總量并不一致，從而帶來試驗數據的變異。為了降低個體間及個體內變異(不同部位)，提高方法的重現性，研究者對DPK方法進行了諸多改進，如采用經皮水分散失值(Transepidermal water loss, TEWL)來反映角質層去除程度等。

Herkenne等[8]的研究中，10名健康受試者前臂屈側皮膚局部外用布洛芬溶液劑，于不同時間點采集用藥部位角質層樣本，稱重，測定每層膠帶中藥物濃度。于用藥部位相鄰皮膚處，以粘性膠帶采集空白角質層樣本，稱重，同時測定TEWL值，根據Fick 第一定律，計算角質層厚度L，獲得藥物濃度在角質層中相對位置(x/L)的分布曲線。然后根據Fick第二定律，采用軟件擬合得到反映藥物經皮擴散的速度和程度的重要參數：擴散系數D/L2和分配系數K，從而計算藥物透皮吸收的遲滯時間Tlag(=L2/6D)及達穩態時間Tss(=2.7Tlag)，預測藥物透皮吸收的量隨給藥時間的變化情況。N'Dri-Stempfer等[12]采用改進的DPK方法評價3種1%硝酸益康唑乳膏的人體生物等效性，除了采用TEWL值來反映角質層去除程度，采取新的清洗步驟和將所有膠帶都納入分析以外，該方法僅在吸收相和消除相各選取一個時間點進行生物等效性評價，每個時間點采用雙樣本。改進后的方法可以減少生物等效性評價所需受試者例數及給藥部位，并且可以降低不同實驗室數據之間的變異。

García Ortiz[13]和Miron[14]通過對比研究發現，膠帶粘貼法僅適用于作用靶位為角質層本身的局部外用藥物，如抗真菌藥，防曬品及抗菌劑等。而對于作用靶位為表皮-真皮的皮膚外用制劑，膠帶粘貼法是無能為力和應用受限的。

2.2 皮膚微透析(dermal microdialysis, DMD) 是一種微創的在體取樣技術，通常是在選定部位植入與皮膚表面平行的具有透析作用的探針，透析液持續流動，保持濃度梯度，定時收集透析液，結合適當的分析設備和技術，實現內源性和外源性小分子或親水性化合物在真皮細胞間液和皮下組織內游離濃度的動態檢測[15,16]。

最早的皮膚微透析研究見于1991年Anderson等關于乙醇的人體透皮吸收的報道。近年來，隨著其方法學[16,17]的不斷發展，該技術已廣泛用于皮膚外用制劑評價、離子電滲藥物轉運、皮膚屏障中轉運蛋白相互作用及疾病相關的生物標志物等方面的研究[16]。

與其他方法相比，DMD具有活體、原位采樣，實時、在線檢測等突出特點。DMD可獲得靶部位中藥物及其代謝物的游離濃度，給出藥物局部轉運的直接相關數據，是獲得以真皮為作用靶位的皮膚外用制劑的在體研究數據的首選方法[15]。可用于正常皮膚、屏障功能不全皮膚[18,19]及皮損皮膚[20]。還可以用于研究更深層次皮膚中藥物濃度。美國FDA及歐盟已批準MD探針用于人體。

然而，MD技術對于水溶性較低(辛醇-水分配系數對數>2.5～3)以及易與蛋白結合的物質，往往需要對灌流液進行優化以改善探針的低回收率[21-23]，使其應用受到限制。而且在如何提高方法的重現性、探針植入與由此引起的組織損傷之間的確切關系，體外滲透研究方法與DMD方法所獲數據之間的相關性以及如何更簡便地適用于脂溶性藥物的研究等方面仍需進行深入研究。

該方法與DPK法相比具有較大的侵入性。對于脂溶性較高，以及預期在角質層起效的物質，其他方法(如DPK法)往往更為適用。

2.3 開流微量灌注(open flow microperfusion, OFM) 是近年來發展起來的一種侵入性較小、持續、無膜的采樣技術。OFM是對微透析的一種改進，它是用肉眼可見的鋼網取代微透析探針的透析膜。與微透析系統相比，由于該系統在組織間液中的交換是開放的，對內源性和外源性物質進行采樣時可不受其分子量、蛋白結合率以及脂溶性的限制，應用范圍更為廣泛[24]。目前經過歐洲CE認證的皮膚開流微量灌注(dermal OFM, dOFM)裝置采用線性設計的探針、0.5 mm的插入針和可穿戴的采用推挽模式的泵。探針的植入深度可以通過高頻超聲波掃描定位(50 MHz)。

Bodenlenz等[25]采用dOFM方法進行了脂溶性抗銀屑病藥物BCT194的皮膚藥代動力學/藥效學研究。9例銀屑病患者分別在皮損和非皮損部位連續8天，每天1次，局部外用0.5% BCT194乳膏，于第1天和第8天分別采集各用藥部位的皮膚間液樣品，連續采集25小時。LC-MS/MS法測定樣品中BCT194濃度，同時采用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測樣品中腫瘤壞死因子(TNFa)水平。結果表明dOFM克服了微透析方法學的限制，適用于皮膚外用制劑的PK/PD研究。

Bodenlenz等[26]的最新研究考察了dOFM技術在5%阿昔洛韋乳膏的生物利用度和生物等效性研究中的準確性、靈敏性和重現性。20名健康受試者每人于六個部位隨機局部外用阿昔洛韋乳膏受試制劑(T)和參比制劑(R)，每個部位植入兩根探針，采樣至36 h，測定真皮內阿昔洛韋濃度動態變化過程，進行生物等效性評價。結果顯示，陽性對照組(R/R)可以得出穩定重現的等效性結論；而陰性對照組(T/R)則顯示兩制劑不等效。該研究結果表明dOFM可以靈敏、重現的表征5%阿昔洛韋乳膏在真皮中的生物利用度，并作為其生物等效性評價的一種方法。

2.4 體外研究方法 體外終點生物等效性研究取決于配方簡單的局部用藥品的體外特性。近來，美國FDA 已經開始認可對簡單的外用藥品配方(非溶液劑)開展體外研究。開展的研究包括體外流變試驗(測試制劑的理化性質)和體外釋放度試驗(In Vitro Release Test, IVRT)。

雖然局部外用制劑中活性成份的體外釋放度試驗可表征成品局部制劑性能特征，作為質量控制的程序，并用于放大和批準后變更的理由，但權威部門通常不接受其作為生物等效性研究的方法。直到2013年美國FDA 公布了關于阿昔洛韋軟膏的研究草案。該指南規定，采用體外方法進行阿昔洛韋軟膏的生物等效性研究必須滿足以下條件：受試制劑和指定參比制劑具有相同的定性和定量組成(Q1/Q2)及物理化學性質(Q3)，并且兩種制劑的體外藥物釋放速率試驗結果一致。

垂直擴散池被認為是測定局部外用制劑中有效成分從制劑中釋放速率并預測藥物生物利用度/生物等效性的最有效的體外模型。美國FDA目前認可采用合成膜進行藥物體外釋放度研究。由于合成膜資源充足，并且可以消除離體皮膚因為年齡、種族、性別、解剖部位不同而帶來的差異，從而可以獲得重現性較高的藥物體外滲透數據。Nallagundla等[27]采用垂直擴散池及多種合成膜比較了南非和印度市場上四種阿昔洛韋普通乳膏相對于新制劑Zovirax乳膏的體外釋放速率。結果表明其90%置信區間均在75%～133%范圍內。

該方法能否適用于除阿昔洛韋以外的其他具有Q1/Q2/Q3一致性的半固體制劑的生物等效性評價還需要進一步的研究。

3 結語

皮膚外用制劑的生物利用度和生物等效性研究相對復雜，并沒有一種唯一的、標準的方法能夠對其做出全面的評價，國際監管機構對于各種方法的接受度不一[11]。根據藥物理化性質和作用靶部位選擇合適的研究方法，或將幾種方法聯合應用可能會得到皮膚外用制劑在作用靶部位吸收、分布及代謝方面的更為全面的數據。