花藥培養(yǎng)技術(shù)在辣椒育種中的應(yīng)用

張嘉園 辛 鑫 劉亞忠 李秋孝 邢澤農(nóng)

（陜西省寶雞市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院辣椒油料研究所，岐山 722400）

辣椒在我國種植面積廣泛，因其含有豐富的辣椒素、維生素C等營養(yǎng)成分，深受大眾喜愛[1]。辣椒（Capsicum annuum L．）屬于常異花授粉植物，天然異交率較高[2]，因而要較快獲得優(yōu)良性狀研究材料難度較大。同時(shí)辣椒有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，在應(yīng)用上主要側(cè)重于雜種一代，而目前常規(guī)育種獲得雜交種所需年限較長、成本較高且穩(wěn)定性差，并非辣椒育種最佳途徑[3]。現(xiàn)今生物技術(shù)作為一類高效育種方式，主要在組織器官培養(yǎng)、分子標(biāo)記等方面有較顯著的進(jìn)展[4]，其中在對辣椒等的應(yīng)用中，花藥培養(yǎng)技術(shù)可以很大程度提高其育種效率[5]，對于推進(jìn)辣椒品種選育及在優(yōu)良性狀穩(wěn)定性控制上起了較大作用。

辣椒染色體數(shù)目為2n=24，為二倍體植株[6]。辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)是通過在一定條件下培養(yǎng)適期辣椒花藥，得到單倍體植株，隨后采用人工或自然加倍獲得雙單倍體（簡稱DH系），從而直接獲得純化的辣椒品系[7]，促進(jìn)后期育種工作的順利進(jìn)行，從而獲得理想效果。

1 應(yīng)用辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)的研究成果

我國辣椒的主要育種目標(biāo)包括：優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗性強(qiáng)以及早熟等幾個方面[7]。研究中采用辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)，2年內(nèi)即可獲得純合二倍體材料，大大提高了育種效率[8]。辣椒花藥培養(yǎng)獲得的單倍體材料，對于引入優(yōu)良基因、基因分析、形態(tài)形成、突變育種等研究上十分高效便捷。現(xiàn)今花藥培養(yǎng)在煙草、水稻、油菜等許多作物上已獲得了較大成功，也培養(yǎng)了大批優(yōu)良性狀的辣（甜）椒品種[9]。

王玉英等[10]最早利用花藥培養(yǎng)獲得躍縣小辣椒花粉再生植株；李春玲等[11]選育出海花一號等甜椒品種；張樹根等[12]育成海豐14號等。R.Dolcet-Sanjuan等[13]利用花藥培養(yǎng)雙單倍體培育出8個不同的辣椒雜交一代。2004-2013年通過國家或地方品種審定委員會審定的、利用雙單倍體技術(shù)選育的辣椒品種有海豐16號[14]、豫07-01[15]等。

2 影響辣椒花藥培養(yǎng)的主要因素

辣椒花藥培養(yǎng)初期，主要是胚狀體的形成，其受多種因素影響，尋找最佳條件得到優(yōu)質(zhì)胚狀體，進(jìn)而分化再生獲得單倍體植株，并通過加倍培養(yǎng)得到相應(yīng)性狀的純合材料，為進(jìn)一步育種提供材料支撐。

2.1 基因型影響 辣椒供體的基因型很大程度上影響辣椒花藥培養(yǎng)[7]，不同類型辣椒胚狀體誘導(dǎo)率大不相同，即使同一種辣椒類型中，不同基因型表現(xiàn)也在很大程度上影響胚狀體誘導(dǎo)形成[16]。

其中不同基因型辣椒花藥培養(yǎng)胚狀體誘導(dǎo)率有所差異，表現(xiàn)為蠟質(zhì)型胚狀體誘導(dǎo)率較高、深綠型次之、再次分別為甜椒和朝天椒類型[17]。另有試驗(yàn)表明，大果基因型辣椒的胚狀體誘導(dǎo)率明顯比小果基因型的辣椒高，袁麗[18]的試驗(yàn)中大果型板椒的誘導(dǎo)率最高達(dá)到了8.33%，而小果型朝天椒僅為0.17%。黃亞杰等[19]的試驗(yàn)表明，易出胚的幾種辣椒均為大果類型。大多數(shù)研究表明：不同基因型辣椒材料在相同培養(yǎng)條件下，胚狀體誘導(dǎo)頻率表現(xiàn)出顯著差異[20]。李春玲等[21]對不同基因型材料在采用相同的培養(yǎng)條件下，胚狀體的誘導(dǎo)頻率變化也有很大差異。

2.2 培養(yǎng)時(shí)期選擇 誘導(dǎo)辣椒花藥產(chǎn)生胚狀體的過程受植株生長環(huán)境及自身生長狀況的影響[17]。前人研究得出：露地栽培的辣椒花藥培養(yǎng)效果比溫室栽培的好[22]。同時(shí)認(rèn)為適宜溫度也是誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生頻率高的重要因素，即25～26℃條件下誘導(dǎo)率較高，超過30℃則誘導(dǎo)率下降[23]。

在株齡方面，由于老齡植株花中小孢子種類復(fù)雜，植株老齡化，畸形花粉數(shù)量增加，導(dǎo)致花藥培養(yǎng)效果較差[23]。從辣椒開花不同時(shí)期上來說，對相應(yīng)時(shí)期花藥進(jìn)行培養(yǎng)，其胚狀體誘導(dǎo)率也有明顯差異，研究表明一般選擇小孢子大部分處于單核靠邊期的花藥能提高培養(yǎng)效率[24]，與李春玲等[25]的觀點(diǎn)一致，認(rèn)為正常季節(jié)，單核靠邊期的花蕾長度一般為0.40cm左右，花瓣與花萼等長，剝掉花瓣所見花藥顏色為黃綠色或略帶紫色。王玉英等[26]也指出單核靠邊期的小孢子對誘導(dǎo)較為敏感，經(jīng)花藥培養(yǎng)的胚誘導(dǎo)率最高。從應(yīng)用上說，4-8月都可進(jìn)行花藥培養(yǎng)，用以高效獲得單倍體植株，提高工作效率[8]。

綜上所述，辣椒的生長環(huán)境、生理狀況、不同發(fā)育時(shí)期的花藥都可影響胚狀體誘導(dǎo)率高低，可通過控制生長條件和花藥發(fā)育時(shí)期，嚴(yán)格在培養(yǎng)前進(jìn)行精確的細(xì)胞學(xué)研究，以確定進(jìn)行花藥培養(yǎng)的花蕾大小和形態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)花藥離體培養(yǎng)的高效進(jìn)行。

2.3 辣椒花藥培養(yǎng)條件

2.3.1 花藥培養(yǎng)預(yù)處理 對辣椒花藥進(jìn)行適當(dāng)預(yù)處理能夠提高胚狀體誘導(dǎo)率。保證花藥接種前及過程中的無菌條件，可減少或避免花藥培養(yǎng)過程中污染、褐化等情況出現(xiàn)。目前，試驗(yàn)中常采用升汞溶液、70%的酒精等進(jìn)行消毒處理[16]，隨后進(jìn)行花藥培養(yǎng)。

對花藥進(jìn)行預(yù)處理的常用方式有低溫、高溫、離心等方式，其中通過溫度預(yù)處理是較常用的方式。研究表明，低溫預(yù)處理能延緩花藥壁和花粉的退化，在花藥壁中積累大量淀粉來促進(jìn)花粉發(fā)育；高溫預(yù)處理是通過中斷配子體發(fā)育，促使其連續(xù)分裂，進(jìn)而較快形成胚狀體[27]。低溫一般選擇3～10℃，也可將花藥在4℃的低溫下處理2d，然后培養(yǎng)直接獲得了花藥胚狀體；高溫一般在30～35℃之間效果較好，更有利于胚狀體的誘導(dǎo)，且頻率較高[28]。也有學(xué)者將分離出的花藥進(jìn)行35℃熱激暗處理8d，比相同溫度下短期處理效果好。低溫處理或高低溫交替進(jìn)行的變溫處理效果比較明顯，但不如高溫處理的效果好[29]，這也與付文婷等[29]的研究結(jié)果一致。因而通過控制預(yù)處理溫度等方式，能較好地控制胚狀體的發(fā)育。

2.3.2 培養(yǎng)基研究進(jìn)展 基本培養(yǎng)基對于花藥胚狀體的誘導(dǎo)至關(guān)重要，現(xiàn)在使用的培養(yǎng)基主要有MS、NHT、N6、NH、C、R等。眾多研究者通過對部分培養(yǎng)基的成分進(jìn)行調(diào)整，也獲得了較好的培養(yǎng)效果。X.Qin等[30]以MS培養(yǎng)基添加激素，進(jìn)行花藥培養(yǎng)，獲得了200余個辣椒花藥培養(yǎng)的胚狀體。陳肖師[31]和王玉英等[26]研究均表明MS、NTH培養(yǎng)基與激素組合的培養(yǎng)基上胚狀體誘導(dǎo)率最高。李春玲等[21]經(jīng)過多年的摸索，配制出SPD培養(yǎng)基，適合辣椒花培胚狀體的誘導(dǎo)。也有用兩種或多種培養(yǎng)基聯(lián)合培養(yǎng)的方式進(jìn)行花藥培養(yǎng)，許多研究者在C和R培養(yǎng)基中分別誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生，隨后二者結(jié)合促進(jìn)進(jìn)一步發(fā)育。張子君等[23]也是采用兩種培養(yǎng)基共同培養(yǎng)的方式，在10個不同類型辣椒中成功地誘導(dǎo)出了胚狀體。

培養(yǎng)基中加入激素、活性炭等能提高胚狀體的誘導(dǎo)率。王玉英等[26]研究表明：低濃度的NAA、IAA的加入，有利于胚狀體的形成。此外不同基因型要求的激素類型及濃度不同，賴?yán)棼惖萚32]在研究新疆加工型辣椒中，篩選出MSB培養(yǎng)基，分別附加2，4-D+TDZ和NAA+KT的誘導(dǎo)辣椒花藥培養(yǎng)的高效培養(yǎng)基組合。活性炭對花藥培養(yǎng)有促進(jìn)作用，可以吸收培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的抑制性物質(zhì)。有研究認(rèn)為，活性炭能夠吸收抑制性物質(zhì)ABA，還可以吸附有益物質(zhì)[33]。王玉英等[26]研究認(rèn)為，培養(yǎng)基中添加0.5%的活性炭比較適合，有利于提高出胚率和成苗率。

2.3.3 辣椒花藥培養(yǎng)外部條件 培養(yǎng)的溫度、光照等對辣椒花藥胚狀體的誘導(dǎo)有較大影響。前人研究多在24～30℃恒溫培養(yǎng)，后來研究者也采用變溫等多種方式進(jìn)行培養(yǎng)，也有較好的效果，如王玉英等[26]在辣椒花藥培養(yǎng)中采用晝夜溫差變動培養(yǎng)，溫度范圍在18～26℃。也有學(xué)者試驗(yàn)表明在35℃條件下高溫培養(yǎng)8d，然后在25～28℃下繼續(xù)培養(yǎng)[16]，其誘導(dǎo)效果明顯。

辣椒花藥愈傷組織誘導(dǎo)時(shí)，初期需要一定的黑暗條件，而進(jìn)一步誘導(dǎo)胚狀體和芽的分化則需要一定的光照條件。E.D.J Supena等[34]將辣椒花藥在9℃條件下培養(yǎng)7d，然后放置28℃條件下進(jìn)行暗培養(yǎng)，獲得了胚狀體。通常也在高溫培養(yǎng)時(shí)采用暗培養(yǎng)，再放入25～28℃的繼續(xù)培養(yǎng)條件時(shí)，進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為1800lx左右[16]。其中光照對愈傷組織和胚狀體誘導(dǎo)方面還未有系統(tǒng)研究，有待進(jìn)一步研究。

2.4 單倍體植株加倍 花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的植株有1/3左右的概率能夠進(jìn)行自然加倍[23]。而通常人工采用一定濃度秋水仙堿誘導(dǎo)單倍體植株加倍，在單倍體植株生長初期，可用秋水仙堿處理幼嫩莖尖或芽，可使單倍體植株加倍，研究表明處理幼苗率加倍效率能達(dá)70%及以上。賴?yán)棼惖萚32]在幼苗生長正常后，用0.25%秋水仙堿加倍處理，約12h左右，達(dá)到染色體加倍的目的，試驗(yàn)效果顯著。

加倍處理的辣椒植株經(jīng)過鑒定可以了解其染色體狀況，通常用細(xì)胞壓片或DNA流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定[29]，鑒定獲得加倍后的正常純合辣椒植株，并進(jìn)一步應(yīng)用到新品種培育當(dāng)中。

3 結(jié)論

辣椒花藥培養(yǎng)作為生物技術(shù)的一種關(guān)鍵技術(shù)，現(xiàn)如今已被廣泛應(yīng)用，前人對此研究涉及育種的多個層面，包括種質(zhì)資源的創(chuàng)新、抗性相關(guān)研究及構(gòu)建目標(biāo)性狀遺傳圖譜等方面。可以加快優(yōu)質(zhì)辣椒材料純化速度，提高育種效率。因而針對辣椒花藥最適培養(yǎng)條件的持續(xù)探索，辣椒不同品種的優(yōu)良植株再生體系的不斷建立[35]，有利于辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)的成熟應(yīng)用，進(jìn)而提高辣椒育種效率。

在育種工作中，利用此項(xiàng)技術(shù)通過分子標(biāo)記輔助選擇與花藥培養(yǎng)相結(jié)合的方法，也可以高效地創(chuàng)制新的加工型辣椒恢復(fù)系材料[36]，由此可知辣椒花藥培養(yǎng)技術(shù)可以單獨(dú)應(yīng)用到辣椒育種中，也可以與其他育種方式相結(jié)合以更好達(dá)到育種目的，從而進(jìn)一步加快辣椒遺傳改良的進(jìn)程，更好滿足對不同辣椒品種日益增長的多樣化需求。

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