黃芪總皂苷對體外培養(yǎng)大鼠神經(jīng)干細胞增殖的影響*

金華倩 丁文倩 儲利勝 李琳

浙江中醫(yī)藥大學浙江杭州310053

神經(jīng)干細胞（NSCs）是一類位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，具有自我更新和多項分化潛能的細胞。成體神經(jīng)干細胞主要在側腦室下區(qū)（SVZ）和海馬齒狀回顆粒下區(qū)（SGZ）。缺血性腦損傷誘導內源性神經(jīng)干細胞增殖、遷移和分化。增強內源性神經(jīng)發(fā)生或神經(jīng)干細胞移植可以促進腦損傷后神經(jīng)修復和功能恢復[1]。黃芪是常用的補氣中藥，能促進腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)修復再生[2]。黃芪總皂苷（TSA）是中藥黃芪的主要有效成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、擴張血管等作用[3-4]。本實驗研究TSA對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的增殖作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：孕13～14天SD（Sprague-Dawley）大鼠，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物質量合格證號：SCXK（滬）2013-0016。

1.2 藥品：黃芪總皂苷，200mg（UV≥98%），購于上海源葉生物科技有限公司，批號：J20F7T9819。

1.3 主要試劑與儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰酶、青-鏈霉素溶液、PBS、Hanks緩沖液（杭州吉諾生物技術有限公司），胎牛血清（美國Gemini公司），EGF、B27（美國Gibco公司），堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）（美國PeproTech公司），細胞消化液Accutase、MTT、BrdU粉末、BrdU小鼠單克隆抗體（美國Sigma公司），多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine)、FITC標記山羊抗小鼠二抗、DAPI（北京中杉金橋生物技術有限公司），Cy3標記山羊抗小鼠二抗（杭州達文生物有限公司），nestin小鼠單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）。超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），酶標儀（美國Bio-Tek公司），倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1.4 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)和傳代：取孕13～14天的SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后，75%乙醇溶液浸泡消毒滅菌，取出胎鼠，將胎鼠置于4℃無菌Hanks溶液中，分離出胎鼠大腦全腦組織，剝除腦膜和血管，將腦組織切成小塊移至離心管內，加入適量0.25%胰酶，放入37℃細胞培養(yǎng)箱中消化15min后取出，膠頭滴管輕輕吹打混勻細胞至不見組織碎片，再加入10%FBS溶液終止消化，經(jīng)200目高壓滅菌的金屬篩網(wǎng)過濾，濾液于1000rpm離心5min，棄上清液，加入適量的NSCs培養(yǎng)基（DMEM/F12+2%B27+20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF+1%青-鏈霉素溶液），接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，原代培養(yǎng)的前3天每天更換培養(yǎng)液，當細胞聚集形成細胞球后2～3天半量換液。原代培養(yǎng)7天第1次傳代，以后5～7天傳代1次。細胞傳代操作：收集細胞液于離心管內，1000rpm離心5min，棄上清液，加入1ml Accutase吹打數(shù)次致懸，放入37℃細胞培養(yǎng)箱中消化5min，室溫1000rpm離心5min，吸棄Accutase，加入1ml培養(yǎng)基重懸，制成單細胞懸液，細胞計數(shù)，以1×106個/瓶接種到新的培養(yǎng)瓶內。第3～5代細胞用于后續(xù)實驗。

1.5 神經(jīng)干細胞鑒定：取第3代神經(jīng)球和NSCs單細胞懸液，加入至經(jīng)多聚賴氨酸處理的24孔板中，每孔加0.5ml的細胞懸液，放入培養(yǎng)箱4h后取出，吸棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定30min后，0.1%Triton X-100處理細胞15min，5%山羊血清37℃濕盒中孵育1h，加一抗體nestin（1∶100），4℃孵育一夜后，加入FITC標記的二抗（1∶100）于37℃黑暗濕盒中孵育1h后，滴加DAPI，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 MTT檢測細胞活性：取消化傳代的NSCs，調整細胞濃度為2×104個/孔，接種于96孔板。加入不同濃度的TSA后分別孵育24、48、72h，共設8組（0、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10μg/ml TSA組），每組5個復孔，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4h，96孔板離心后吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，置于搖床震蕩10min，用酶標儀在490nm波長處測定吸光度值。

1.7 BrdU/Nestin免疫熒光雙標檢測神經(jīng)干細胞增殖：取消化傳代的NSCs，調整細胞濃度為1×105個/孔，接種于有預先包被0.01%多聚賴氨酸的蓋玻片的24孔板內培養(yǎng)，TSA（0、1、2μg/ml）同時加入BrdU（10 μmol/L）處理48h后，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定30min，0.25%Triton X-100破膜20min，加2mol/L的HCl室溫下變性30min，加入0.1mol/L的硼酸鈉（pH 8.5）中和反應10min，3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶室溫下孵育20min，加羊血清工作液封閉于37℃1h，加一抗BrdU（1∶100）于4℃孵育過夜，次日加Cy3標記的山羊抗小鼠熒光二抗（1∶100），于37℃避光孵育1h，再加羊血清工作液封閉于37℃孵育1h，加一抗nestin（1∶100）工作液4℃孵育過夜，次日加FITC標記的山羊抗小鼠熒光二抗（1∶100），于37℃避光孵育1h，再滴加DAPI，于熒光顯微鏡下觀察。每組隨機計數(shù)6個視野下BrdU陽性細胞數(shù)，計算細胞增殖率/%=BrdU陽性細胞總數(shù)/Nestin陽性細胞總數(shù)×100%。

1.8 統(tǒng)計學方法：應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以±s表示。采用單因素方差分析（ANOVA）并SNK進行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 神經(jīng)干細胞的細胞形態(tài)：原代培養(yǎng)第2天鏡下可見部分細胞貼壁，部分細胞懸浮呈球狀，第3代細胞聚集呈細胞球，折光性好。見圖1。

圖1 NSCs形態(tài)

2.2 神經(jīng)干細胞的鑒定：免疫熒光結果顯示，神經(jīng)球表面基本完全呈nestin陽性表達，單個NSCs近92%呈nestin陽性表達。見圖2。

2.3 黃芪總皂苷對神經(jīng)干細胞的增殖作用：MTT實驗結果顯示，不同濃度TSA孵育NSCs 24、48、72h后，同一時間點，與0μg/ml TSA組比，1、2μg/ml TSA組的細胞存活率差異顯著（P＜0.05），其作用于48h效果最顯著（P＜0.01）。見圖3。

圖2 NSCs鑒定

圖3 不同濃度TSA作用不同時間對NSCs增殖的影響（n=5）

2.4 BrdU/Nestin免疫熒光雙標檢測神經(jīng)干細胞增殖結果：BrdU/Nestin免疫熒光雙標結果顯示1、2μg/ml TSA孵育NSCs 48h后，BrdU陽性細胞比例均較對照組（0μg/ml TSA）顯著增多（P＜0.01）。見圖4。

圖4 TSA作用48h對NSCs增殖的影響（n=6）

3 討論

神經(jīng)干細胞具有自我更新能力，并能分化為神經(jīng)元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。Nestin又名巢蛋白，是一種中間絲蛋白，主要在NSCs內一過性表達，當NSCs向終末細胞分化后，Nestin表達停止。所以巢蛋白常被用來標記NSCs。我們采用Nestin標記神經(jīng)球和單個NSCs，均證實我們培養(yǎng)的NSCs純度達到90%以上。

腦卒中能誘導NSCs增殖、遷移和分化，促進損傷的腦組織修復和神經(jīng)功能恢復。但在無任何干預的情況下，腦缺血后死亡的神經(jīng)元中僅有0.2%被新生神經(jīng)元替換，不足以改善缺損的神經(jīng)功能[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，藥物治療可以促進腦缺血后NSCs增殖、遷移和分化。研究表明，一些中藥及其活性成分不僅可以保護神經(jīng)細胞，而且能促進NSCs的增殖并誘導其定向分化為神經(jīng)元，達到治療神經(jīng)功能缺損疾病的目的[6]。中藥黃芪具有免疫調節(jié)、抗炎、抗氧化、改善腦血流等作用[7]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)黃芪能促進腦缺血后NSCs增殖分化[8]。韋云飛等[9]研究也發(fā)現(xiàn)黃芪注射液能促進腦缺血后NSCs增殖和分化。黃芪皂苷是黃芪的主要有效成分之一，具有神經(jīng)保護和抗缺血性腦損傷作用[10-11]。本研究首先采用MTT法檢測發(fā)現(xiàn)TSA促進NSCs增殖具有劑量和時間依賴性，其中1、2μg/ml TSA處理48h的作用最顯著，采用BrdU標記NSCs進一步證實TSA促進NSCs增殖。

總之，黃芪總皂苷促進體外培養(yǎng)的NSCs增殖，但是否促進腦缺血后神經(jīng)干細胞增殖，以及促進增殖的機制還有待進一步研究。

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