兩種根際促生菌在不同氮磷條件下對油菜生長和養分吸收的影響①

王 丹，趙學強，鄭春麗*，沈仁芳

(1 內蒙古科技大學生命科學與技術學院，內蒙古包頭 014010；

2土壤與農業可持續發展國家重點實驗室(中國科學院南京土壤研究所)，南京 210008)

我國是世界油菜主產國，油菜種植面積和總產量均居世界首位[1]。油菜是產油效率最高的油料作物之一，菜籽油占國產油料作物產油量的 57.2%，在食用油供給的地位舉足輕重[2]。然而，目前我國食用油消費的 60% 以上依賴于進口[3]，進一步推動油菜產業的發展對于提高我國食用油自給率和保障食用油供給安全具有重要戰略意義。

油菜產業的發展離不開化肥，氮磷鉀肥對提高油菜產量尤其重要。據分析，中國油菜施用氮肥增產量和增產率均值分別為1 044 kg/hm2和87.4%，磷肥增產量和增產率均值分別為634 kg/hm2和39.9%，鉀肥增產量和增產率均值分別為420 kg/hm2和22.9%，總體表現為氮肥＞磷肥＞鉀肥[4]。然而，油菜對化肥的利用率卻很低。對長江流域油菜氮磷鉀肥料利用率現狀研究表明，氮肥、磷肥、鉀肥的表觀利用率分別為34.0%、17.4% 和 36.9%[5]，所以施入土壤中的化肥僅有1/3左右被油菜當季吸收，而剩下的約2/3留在環境中。過量施用化肥會導致土壤酸化、土壤板結、水體富營養化、溫室氣體排放增加、農產品品質降低等一系列問題，這對于環境質量和農業可持續發展都構成了巨大威脅[6]。因此，提高油菜產量和化肥利用率是油菜產業可持續發展中面臨的雙重挑戰。在這種狀況下，我們需要尋求新的科學途徑，以維持油菜產業的可持續發展。

微生物直接參與了植物獲得養分和土壤養分循環兩個過程，大量試驗已證明土壤微生物在植物獲得土壤養分方面發揮著重要作用[7]。根際是根系周圍數毫米的微區域，是植物吸收養分的“門戶”。根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指一群定植于植物根際，能夠促進植物生長的一類細菌代表。這類細菌包括的種類主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、固氮螺菌屬、固氮菌、克雷白氏桿菌、農桿菌屬、黃桿菌屬、伯克氏菌屬以及沙雷氏菌屬等20 多個種屬[7-9]。添加根際促生菌能夠通過刺激根系生長、溶解土壤難溶性磷、固氮等一系列生理生化機制，來增強植物獲得養分的能力。此外，PGPR也可通過分泌鐵載體和產生抗生素等間接作用提高植物抗逆性[10]，預防和控制作物病害，降低農藥和化肥的施用量，被普遍認為是一種環境友好、經濟有效的提高作物產量的方法[11-14]。

目前已從油菜根際土壤分離到一些根際促生菌，它們能夠改善油菜生長并提高養分吸收[15-17]。許多研究也表明，通過接種外源根際促生菌，能夠改善油菜生長，提高油菜養分吸收能力，降低化肥施用量[18-27]。上述這些研究大都將根際促生菌的促生機制歸結為油菜吸收大量元素N、P、K能力的改善，而很少關注中微量元素。油菜是一種對微量元素十分敏感的作物類型，如缺硼會導致油菜“花而不實”，以及花青素含量的積累，顯著影響油菜產量。除此之外，缺鐵會阻礙油菜新葉葉綠素的形成，缺鋅則對葉綠素a、類胡蘿卜素產生一定影響[28]。另外，根際促生菌的效果取決于油菜體內養分狀況，在不同的氮磷鉀供應狀況下，根際促生菌對油菜表現出不同的效果[29]。綜合這些因素，本文研究了兩種不同芽孢桿菌在不同氮磷供應條件下對油菜吸收大量元素和中微量元素的影響，以期闡明根際促生菌對油菜生長的影響及其機制，為提高油菜產量和肥料利用率提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用土壤為南京市橫溪基地水稻土，農民種植方式為水稻-油菜輪作，土壤基本理化性質：pH 6.20，有機質9.94 g/kg，全氮1.50 g/kg，有效磷16.18 mg/kg，速效鉀89.13 mg/kg。供試油菜品種為寧油16號，屬半冬性甘藍型油菜(Brassica napus)品種。氮肥為尿素，N 200 mg/kg干土；磷肥為過磷酸鈣，P 100 mg/kg干土；鉀肥為氯化鉀，K 200 mg/kg干土。試驗使用菌種為巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。

1.2 試驗方法

1.2.1 盆栽試驗 試驗在中國科學院南京土壤研究所溫室進行，試驗周期為2015年12月10日至2016年4月14日。試驗用盆缽為直徑12 cm、高度8 cm的聚乙烯塑料盆，每盆裝土1.5 kg，定植5棵幼苗。土樣在裝盆前經風干磨細過篩，并經高溫高壓蒸汽滅菌，以消除土壤里面土著微生物的影響。設置氮磷均施、不施磷施氮、不施氮施磷3組施肥處理，每組施肥處理再分為不接種、接種巨大芽孢桿菌、接種短小芽孢桿菌3組菌劑處理。播種前肥料與土壤混合后裝盆，所有試驗處理均施用鉀肥。將保存的菌種進行活化，然后接入液體LB培養基，在30 ℃ 和200 r/min進行搖床培養，測定菌液OD值大約為1時，將菌液在3 500 r/min下進行離心10 min，離心后的沉淀用雙蒸水重懸。用移液槍吸取1 ml菌液打到土壤中每株幼苗的根部。每組試驗重復3次。油菜生長期間，根據土壤濕度情況，適當澆水。

1.2.2 樣品采集與測定方法 油菜植株收獲后，經105 ℃殺青，70 ℃ 烘干稱重，樣品經磨樣機粉碎后供分析養分含量。地上部樣品經HNO3-HClO4消煮，用ICP-OES (Inductively Coupled Plasma-Optical Emission Spectrometer) (Thermo Scientific iCAP 7000)測定P、K、Ca、Mg、S、Cu、Zn、Fe、B等元素含量；植株全氮含量用凱氏定氮儀測定。按常規法測定土壤基本理化性狀：土壤 pH 按水土比 2.5∶1.0，pH 計測定；采用重鉻酸鉀容量法測有機質；凱氏定氮法測土壤全氮；0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測有效磷；1 mol/L NH4OAc 浸提-火焰光度法測速效鉀。

1.3 數據處理

采用Excel和SPSS 20對數據進行處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌對油菜生長的影響

圖1表明，不管是未接種處理還是兩種菌劑處理，缺氮和缺磷兩個處理地上部干重僅為氮磷均施的 1/5左右，表明油菜生長對氮磷缺乏非常敏感，但是缺氮和缺磷兩個處理之間地上部干重差異不顯著。在氮磷均施處理下，與未接種處理相比，接種巨大芽孢桿菌顯著增加了油菜地上部干重，但是接種短小芽孢桿菌沒有表現出效果，甚至有降低油菜地上部干重的趨勢。在缺氮和缺磷兩個處理下，兩種菌劑處理和對照之間沒有顯著差異。這些結果表明，油菜對缺氮和缺磷非常敏感，巨大芽孢桿菌在氮磷供應的條件下具有促生效果，而短小芽孢桿菌在目前試驗條件下沒有效果。

圖1 根際促生菌對油菜干重的影響Fig. 1 Effects of PGPRs on dry weights of rape

2.2 芽孢桿菌對油菜地上部大量元素含量的影響

表 1比較了在同一施肥處理下接種巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌對油菜地上部N、P、K含量的影響。結果表明：①同一施肥處理下3種菌劑處理之間油菜地上部 N含量沒有顯著差異；②巨大芽孢桿菌處理油菜地上部 P含量顯著高于未接種處理和短小芽孢桿菌處理，而未接種處理和短小芽孢桿菌處理之間沒有顯著差異；③與未接種處理相比，巨大芽孢桿菌僅在氮磷均施處理下增加了油茶地上部 K含量，而在缺氮和缺磷條件下對 K含量沒有影響；相反，短小芽孢桿菌在缺氮和缺磷條件下降低了 K含量，而在氮磷均施處理下對K含量沒有影響。

表1 根際促生菌對油菜地上部大量元素含量的影響(mg/g)Table 1 Effects of PGPRs on the contents of macroelements of rape shoots

2.3 芽孢桿菌對油菜地上部中量元素含量的影響

表 2比較了在同一施肥處理下接種巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌對油菜地上部Ca、Mg、S含量的影響。結果表明：①在氮磷均施處理下，3種菌劑處理之間油菜地上部所有中量元素含量沒有顯著差異；②在缺磷處理下，與未接種處理相比，巨大芽孢桿菌增加了油菜地上部Ca和S含量，沒有影響Mg含量；而短小芽孢桿菌對Ca、Mg、S含量均沒有影響；③在缺氮處理下，與未接種處理相比，巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌對油菜地上部Ca、Mg、S含量均沒有影響。

2.4 芽孢桿菌對油菜地上部微量元素含量的影響

表 3比較了在同一施肥處理下接種巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌對油菜地上部Cu、Zn、Fe、B含量的影響。結果表明：①在氮磷均施處理下，與未接種處理相比，巨大芽孢桿菌增加了油菜地上部Zn和B含量，沒有影響Cu和Fe含量；而短小芽孢桿菌降低了Cu含量，對Zn、Fe、B含量沒有影響；②在缺磷處理下，與未接種處理相比，巨大芽孢桿菌增加了油菜地上部Cu、Zn、Fe、B含量，而短小芽孢桿菌對這4種元素含量均沒有影響；③在缺氮處理下，與未接種處理相比，僅巨大芽孢桿菌增加了油菜地上部B含量，對Cu、Zn、Fe含量沒有影響，而短小芽孢桿菌對這4種元素含量均沒有影響。

3 討論

本文試驗結果表明，不管是缺氮還是缺磷，油菜生物量僅為氮磷均施條件下的20%，表明油菜對缺氮和缺磷非常敏感。保證充足的氮磷供應是油菜高產穩產的必需條件，這與李慧等[4]根據我國油菜氮磷增產率調研結果得出的結論相一致。在研究中也注意到，相對于一些大田糧食作物水稻、小麥和玉米，油菜根系較小，而且不容易深扎，導致油菜根系從土壤中攝取養分的區域范圍較小，所以必須增加土壤養分供應量，即增加根際區域養分濃度，才能保證油菜獲得足夠的養分，以維持其正常生長。油菜氮效率與根系形態、生理特性有著密切關系[30]。因此，改良油菜根系是提高油菜獲得養分能力的一條有效途徑。

表2 根際促生菌對油菜地上部中量元素含量的影響(mg/g)Table 2 Effects of PGPRs on contents of secondary elements of rape shoots

表3 氮磷肥和根際促生菌對油菜微量元素含量的影響(μg/g)Table 3 Effects of PGPRs on contents of microelements of rape shoots

根際促生菌的作用機制大致可以概括為直接促進作用和間接促進作用。直接促進作用是微生物能夠為植物提供一些合成復合物，或者促進根系從環境吸收養分。根際促生菌可以通過固氮為植物提供氮源；合成鐵載體從土壤中溶解鐵提供給植物細胞；合成一些激素刺激植物的生長發育；溶解土壤難溶態磷，提高磷的生物有效性；合成一些低分子化合物或酶，調節植物發育[31-33]。不同根際促生菌可能會利用以上機制的一種或幾種來影響植物生長發育。間接促進作用是根際促生菌能減少或阻止病源性微生物，提高植物抗病性的主要原因，即生防作用。根際促生菌還可以調節改善根際土壤的微生物群落結構、生理代謝與功能，影響土壤養分的轉化，間接影響植物生長[34]。可見，根際促生菌的作用機制多種多樣，本文從養分吸收角度來解釋根際促生菌的作用機制。植物公認的必需元素有 17種，除C、H、O可以通過光合作用來源于大氣外，N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、Cu、Zn、Mo、B、Cl、Ni等14種元素主要來源于土壤，被稱為礦質營養元素。任何一種必需元素的缺乏都會限制植物的生長。

本文中，在氮磷適量供應條件下，巨大芽孢桿菌表現出了促生效果，而短小芽孢桿菌沒有促生效果，甚至有輕微抑制效果。為了探究巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌促生效果差異的可能機制，我們分析了油菜地上部 N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Cu、Zn、B 10種必需元素的含量。結果表明，在氮磷供應條件下，接種巨大芽孢桿菌增加了油菜地上部P、K、Zn和B含量，對其他元素含量沒有影響，相反，接種短小芽孢桿菌對所有分析的元素含量都沒有影響。根據這些結果，我們推測巨大芽孢桿菌的促生機制可能是巨大芽孢桿菌增加了油菜對P、K、Zn和B 4種營養元素的吸收。僅僅根據這些數據，還不能完全回答巨大芽孢桿菌促進油菜吸收P、K、Zn和B的確切機制，其機制可能是上述根際促生菌的直接促進和間接促進機制中的一種或幾種，如增大根系、提高土壤養分有效性、改變土壤微生物群落結構等。雖然巨大芽孢桿菌和短小芽孢桿菌都屬于芽孢桿菌屬，但是每一種根際促生菌株都有其特定的生物學特性，對于植物的促生效果也不盡相同。例如，簡單芽孢桿菌 JM170能提高苜蓿固氮酶活性、根系的溶磷量與 IAA 分泌的能力[35]，而JX59只能增加燕麥根系的溶磷量，不具備提高固氮酶活性的能力[36]。土壤類型、環境條件、菌種類型和植物種類等因素都可能影響到根際促生菌作用的發揮[34]。

一些報道也表明根際促生菌能夠促進油菜對N、P、K養分的吸收，而對于中微量營養元素的關注較少。例如，多黏芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)提高了油菜的生物固氮能力[26]；Bacillus edaphicus提高了油菜對 K的吸收[25]；Pseudomonas fluorescens和Enterobacter radicincitans促進了油菜對P的吸收；Achromobacter增加了油菜對NO-3-N和K的運輸[17]；巨大芽孢桿菌增加了油菜N、P、K含量[18-20]。也有報道表明，雖然解磷菌促進了油菜生長，但是機制不是因為增加了 P吸收[23]。本文的研究結果表明，巨大芽孢桿菌主要促進了P、K、Zn和B 4種營養元素的吸收，而對于 N、Ca、Mg、S、Fe、Cu等元素的吸收促進效果較小。因此，不同根際促生菌在不同土壤上對油菜的促生機制不一樣。

雖然在氮磷正常供應條件下，接種巨大芽孢桿菌增加了油菜地上部生物量，但是在缺氮或缺磷試驗條件下，接種巨大芽孢桿菌沒有表現出改善油菜生長的效果。元素分析結果表明，在缺氮或缺磷條件下，巨大芽孢桿菌也促進了一些元素的吸收，但是短小芽孢桿菌對所有測定元素沒有表現出促進作用。我們推測，在缺氮或缺磷條件下，巨大芽孢桿菌沒有促生效果的原因是土壤有效氮和有效磷含量遠低于油菜生長的臨界值，即使巨大芽孢桿菌在缺氮或缺磷條件下提高了一些元素的吸收，但是由于缺氮和缺磷是油菜生長的最主要限制因子，根際促生菌的作用也難以發揮。只有在缺氮和缺磷這兩個限制因子消除后，即在正常氮磷供應條件下，巨大芽孢桿菌的促生效果才得以表現。

本文試驗結果是在滅菌土培條件下獲得的，這與實際條件相差較大，巨大芽孢桿菌在田間條件能否表現出促生效果仍不清楚。因此，將來需要進一步在田間條件下研究巨大芽孢桿菌對油菜生長和養分吸收的影響，以推動該菌種在農業上的應用。

4 結論

1) 油菜對缺氮和缺磷十分敏感，缺氮或缺磷下油菜地上部生物重僅為正常氮磷供應條件下的20%，氮磷肥對油菜生長至關重要；

2) 巨大芽孢桿菌僅在氮磷均施的條件下促進了油菜生長，而在缺氮或缺磷條件下沒有表現出促生效果，其機制可能是巨大芽孢桿菌在氮磷均施條件下促進了油菜對P、K、Zn和B 4種營養元素的吸收；

3) 短小芽孢桿菌在缺氮、缺磷或正常氮磷條件下都沒有表現出促生作用，對養分吸收也沒有促進作用。

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