水稻細胞色素P450基因OsDWARF48調控株高的功能分析

李臻　王慶國　潘教文　劉煒

摘要：本研究以水稻中花11為材料克隆了一個P450家族基因，命名為OsDWARF48。該基因在水稻中為組成型表達，在幼胚中的表達量最高；并且其表達受到BR的抑制。進一步以獲得的基因過表達及反義轉基因植株為材料，對株高進行測量，結果顯示，OsDWARF48反義轉基因株系株高明顯矮于對照，而過表達轉基因株系OE3株高明顯高于對照。通過對水稻內源生長素、油菜素內酯和赤霉素的含量測定，發現3種激素在反義轉基因株系中含量均下降，在過表達轉基因株系OE3中含量均上升，表明OsDWARF48通過調控BR合成及信號轉導途徑，進而與GA和IAA協同作用調控水稻株高。

關鍵詞：水稻；細胞色素P450基因OsDWARF48；株高；油菜素內酯

中圖分類號：S511.3+2：Q785 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0001-09

Abstract In this research， a P450 family gene named as OsDWARF48 was cloned from rice variety Zhonghua 11. OsDWARF48 was constitutively expressed in various rice tissues and the highest expression was found in immature embryos， and its expression could be inhibited by BR. After the rice lines with over- and anti-sense expression of OsDWARF48 were obtained， the plant height was measured. The height of anti-sense transgenic lines was shorter while that of over-sense transgeinic line OE3 was higher compared to the control. The detection of endogenous BR， IAA and GA in different rice lines showed that their contents decreased in anti-sense transgenic lines with shorter height， but increased in the OE3 line with higher height. The results above indicated that OsDWARF48 might control the plant height of rice by regulating the synthesis and signal transduction pathways of BR and further synergy with GA and IAA.

Keywords Rice； Cytochrome P450 gene OsDWARF48； Plant height； BR

株高是水稻株型的主要決定因素，同時也是重要的農藝性狀，直接關系到水稻的收獲指數和增產潛力，過高易引起莖稈的倒伏造成減產。20世紀50年代研究者們發現水稻半矮稈基因sd1并進行廣泛應用，其通過降低株高使水稻單產提高20%～30%，被稱為“第一次綠色革命”，如今仍作為株高重要的調控基因被應用于育種中[1]。但是攜帶sd1的材料具有抗旱性差、光合效率低等缺點，也成為制約水稻新品種選育的瓶頸[2]。因此繼續挖掘水稻矮化新品種，開展株高相關基因定位及功能研究，對水稻育種和生產具有重要指導意義。

水稻莖稈的生長發育受多種因素影響，其中植物激素、轉錄因子、細胞周期、微管及微絲的排列、細胞壁合成、光合產物合成及轉運等相關基因都具有重要作用[3-5]。對水稻中調控株高相關基因的功能進行分析，發現其中大多數與赤霉素（gibberellin， GA）、油菜素內酯（brassinolide， BR）及生長素（auxin， IAA）的代謝或信號轉導相關：除了直接參與激素合成及信號轉導的相關基因，如GA合成及信號傳導相關基因d18、d35、OsGA20ox1、OsKS1、SLR1，BR合成及信號傳導相關基因D2、d11、brd2、OsBRI1等[6，7]；還有部分基因能夠通過調控激素的合成及信號轉導影響水稻株高，如NAC轉錄因子OsNAC2通過調控水稻GA信號通路關鍵基因OsSEATB和OsKAO的表達，影響GA的積累從而負調控水稻株高[8]；受體激酶LRK1基因下調OsKO2的表達，通過限制GA的合成調控水稻節間伸長[9]。以上研究顯示激素在調節水稻株高中起主導作用。

細胞色素P450（cytochrome P450， CYP450）是一類血紅素蛋白，屬于單加氧酶超家族，其主要功能是催化有機化合物的氧化還原反應，因其最低能量吸收峰在450 nm處而得名。1958年，Kligenberg 和 Gerfinkel 首次在大鼠肝微粒體中報道了該基因，現已證明其存在于細菌以及動植物的各個組織中[10]。CYP450通過N端的疏水序列錨定在膜上，屬于膜定位蛋白，在真核細胞中主要分布在內質網和線粒體內膜上。作為一種末端加氧酶參與包括植物激素、信號分子、黃酮類、甾醇類、萜類等多種初級和次級合成及代謝反應[11，12]，同時在植物響應生物、非生物脅迫[13，14]及植物除草劑抗性[15，16]等方面具有重要作用。水稻中含有47個CYP450家族，其中部分基因的功能獲得解析，如DSS1編碼細胞色素氧化酶CYP96B4家族成員，通過協調GA和ABA平衡，介導水稻生長以及脅迫應答，同時可能還在脂類代謝中發揮作用[17]；CYP78A13能促進細胞增殖，有增加株高并提高籽粒產量的潛力[18]；過表達CYP71Z2能夠持續且穩定提高水稻對白葉枯病菌（Xoo）的抗性，而CYP71Z2-RNAi株系與野生型一致，對Xoo的抗性沒有明顯差異[19]。截至目前，大部分CYP450的基因功能還沒有獲得研究。

本課題組前期在水稻黑條矮縮病相關基因數字表達譜的基礎上，鑒定到一個表達明顯上調的基因，功能注釋為CYP450基因， KEGG預測其參與油菜素內酯合成過程。本研究克隆了該基因，并將其命名為OsDWARF48（LOC_Os04g48200），BLAST分析顯示，該基因編碼蛋白為CYP450家族CYP87A3樣蛋白，其表達受油菜素內酯的抑制，推測其可能參與油菜素內酯的合成或代謝過程。其反義及過表達轉基因株系中，部分水稻株高發生變化，并與轉基因株系內源油菜素內酯含量及相關基因的變化呈一定相關性。本研究結果對于水稻株型改造及品質改良具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水稻中花11種子由本實驗室保存。

大腸桿菌DH5ɑ購自Transgen公司（山東濟南雨同生物科技有限公司）；農桿菌LBA4404由本實驗室保存；克隆載體pMD18-T購自TaKaRa（日本）公司；植物雙元表達載體p1301-bar-UBI由山東農業大學溫孚江教授惠贈，該載體是以pCAMBIA1301為骨架改造而成，含有除草劑Basta抗性基因bar和單子葉植物Ubiqutin啟動子。

1.2 RNA的提取及反轉錄

按照TransZol Plant 試劑盒（Code： ET101-01，購自Transgen公司）說明書提取水稻組織總RNA，并參照TaKaRa PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit （Code： D6110A） 試劑盒說明書將檢測合格的RNA反轉錄合成第一鏈cDNA。

1.3 OsDWARF48基因克隆及生物信息學分析

以反轉錄的水稻葉片單鏈cDNA為模板，根據OsDWARF48核苷酸序列（NCBI登陸號：XP_015635235.1），設計并合成特異性引物LDWARF48，進行PCR擴增，引物序列見表1。反應條件為：94℃ 10 min；94℃ 45 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s，30個循環；72℃延伸10 min。將獲得的DNA片段連入克隆載體pMD-18T中，經酶切鑒定后，陽性質粒由山東省農業科學院生物技術研究中心測序室進行序列測定。利用水稻基因組注釋網站Rice Genome Annotation Project （http：//rice.plantbiology.msu.edu）對OsDWARF48的基因結構及編碼蛋白基本信息進行分析。

1.4 OsDWARF48表達模式分析

分別提取生長4周水稻幼苗的葉片、莖稈、根以及花、未成熟胚和成熟種子的總RNA，以反轉錄產物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內參，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsDWARF48基因在不同組織器官中的表達模式。

用10 μmol/L油菜素內酯處理生長2周的水稻幼苗，在0、2、6、12 h分別取材提取總RNA，以反轉錄產物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內參，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析OsDWARF48基因對BR的響應模式，所用引物為qACTIN和qDWARF48，引物序列見表1。

1.5 植物表達載體的構建及水稻的遺傳轉化

選取測序正確且正向連接的克隆載體pMD18T-OsDWARF48-O和反向連接的克隆載體pMD18T-OsDWARF48-R，用PstⅠ和SamⅠ分別雙酶切含有目的基因的這兩個克隆載體以及植物雙元表達載體p1301-bar-UBI，切膠回收目的基因片段和線性化的植物表達載體，經T4 ligase連接，將酶切鑒定正確的陽性重組質粒命名為pCA1301-bar-OsDWARF48-O和pCA1301-bar-OsDWARF48-R。構建成功的植物雙元表達載體用熱激法轉入農桿菌菌株LBA4404中，侵染水稻愈傷組織，用10 mg/L的PPT進行3次抗性篩選，經誘導及分化獲得轉基因組培苗。

轉基因苗在土中生長至6葉期，用濃度為0.2%的Basta溶液涂抹葉片進行抗性篩選。篩選出的陽性苗，提取其葉片DNA，利用LDWARF48上游引物與Nos下游引物組合檢測正義過表達轉基因陽性植株；利用LDWARF48下游引物與Nos下游引物組合檢測反義轉基因陽性植株，引物序列見表1。獲得確定陽性轉基因株系，經多代篩選獲得T3代純合株系。

1.6 株高測定

水稻幼苗株高測定是以水培兩周的植株為材料，測定標準為從莖基部到最上面葉片頂端；成熟期水稻株高測定是以生長到抽穗期的水稻為材料，測定標準是從莖基部至穗頂部的長度；每株重復測量3次，取3次平均值為該株的株高，每個株系測量15株。結果用SPSS（23.0）統計軟件進行差異顯著性分析。

1.7 水稻內源油菜素內酯、生長素、赤霉素含量的測定

取生長兩周的對照及轉基因水稻葉片材料0.2 g，應用酶聯免疫吸附技術（ELISA）分別測定水稻葉片中BR、GA、IAA含量。為減少試驗誤差，每一個材料取10株混樣，并設定3個生物學重復，該試驗委托北京北農天一生物技術有限公司完成。結果用SPSS（23.0）統計軟件進行差異顯著性分析。

1.8 實時熒光定量PCR

根據基因D2、D11、OsBR6ox、OsBRI1、OsBZR1和OsBAK1的全長序列設計實時熒光定量PCR引物，重點對油菜素內脂合成途徑中相關基因的表達進行鑒定，基因及引物序列見表1。反應在ABI PRISM 7900 HT（Applied Biosystems）熒光定量PCR儀上進行，反應體系為20 μL，方法參照FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）說明書。反應條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，40個循環。按照2-ΔΔCT法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 基因克隆及生物信息學分析

本研究以水稻品種中花11單鏈cDNA為模板，利用引物LDWARF48克隆水稻CYP450家族基因OsDWARF48。該基因全長為1 449 bp，含有9個外顯子，編碼483個氨基酸。生物信息學分析顯示：該基因編碼蛋白分子量為55.09 kD，等電點為8.47，負電荷殘基數（Asp+Glu）52，正電荷殘基數（Arg+Lys）55，不穩定系數41.76，是一種不穩定蛋白。該蛋白含有1個P450保守結構域和1個跨膜區，序列前端沒有信號肽。與已知功能的水稻（Oryza sativa L.）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中的CYP450蛋白進行序列比對顯示OsDWARF48編碼蛋白含有CYP450的典型基序（圖1）。BLAST結果顯示，OsDWARF48編碼CYP87A3樣蛋白，與谷子（Setaria italica）中CYP87A3蛋白序列相似性較高（圖2）。

2.2 OsDWARF48在水稻不同組織中的表達模式

以反轉錄產物為模板，以水稻Actin基因（LOC_Os03g50885）為內參，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）方法分析基因OsDWARF48的表達模式。結果顯示，OsDWARF48為組成型表達。以該基因在根中的相對表達量為參照，其在幼胚中的表達量相對較高，約是根中的90倍；其次在種子和莖中的表達量也較高，分別是根中表達量的11.22倍及7.73倍；而在花和葉中的表達量相對較低（圖3）。

2.3 OsDWARF48誘導表達模式

水稻幼苗經BR處理后，隨著處理時間增加，OsDWARF48的表達量逐漸下降，處理2 h的相對表達量為0.84；處理6 h時表達明顯下調，為未處理時的29%，隨處理時間進一步延長，其相對表達量一直維持在較低水平（圖4）。

2.4 轉基因株系的獲得

轉基因組培苗，經繼代、Basta（購自日本農藥株式會社公司）抗性篩選及PCR鑒定，最終獲得2個純合反義株系（AS1、AS2）和3個過表達轉基因株系（OE1、OE2、OE3）。通過熒光定量PCR檢測轉基因株系中OsDWARF48基因的表達量，結果顯示，反義及正義轉基因株系幼苗中該基因的表達量都有不同程度的提高（圖5），說明基因已經成功轉化到水稻品種中花11中。

2.5 水稻株高測定結果

對生長2周的幼苗以及田間灌漿成熟期的水稻株高進行測量，發現在幼苗期反義轉基因株系AS1、AS2的株高分別為10.29、10.84 cm，分別為對照株高的73.87%和77.82%；在田間灌漿成熟期AS1、AS2的株高分別為106.88 cm和107.51 cm，分別為對照株高的92.98%和93.54%。統計分析顯示在幼苗期和成熟期AS1、AS2株高均與對照相比差異顯著，幼苗期差異更加明顯。幼苗期過表達轉基因株系OE3株高為16.66 cm，為對照的119.60%；田間灌漿成熟期OE3株高為123.6 cm，為對照的107.53%。統計分析顯示在幼苗期和成熟期OE3株高均與對照相比差異顯著，幼苗期差異更加明顯。綜上所述，反義轉基因株系AS1、AS2的株高低于對照且差異顯著，過表達轉基因株系OE3株高高于對照也差異顯著，而OE1和OE2的株高與對照相比沒有明顯差異（圖6）。

2.6 水稻幼苗內源激素含量

利用ELASA方法測定轉基因各株系及對照植株中內源BR、IAA和GA含量。其中BR含量在反義轉基因株系AS1、AS2中分別比對照低2.29 ng/gFW和1.61 ng/gFW；在過表達轉基因株系中均有升高，且在OE3中比對照高2.22 ng/gFW；統計分析顯示AS1、AS2及OE3中的含量與對照相比差異顯著。而GA和IAA含量除在OE3中略有升高外，其它株系中含量比對照均有不同程度下降，且含量與對照相比差異顯著（圖7）。

2.7 不同水稻株系中BR合成或信號轉導相關基因的表達變化分析

以對照及轉基因水稻株系為材料，應用熒光定量方法對BR合成相關基因D2、D11、OsBR6ox以及信號轉導相關基因OsBRI1、OsBZR1、OsBAK1的相對表達量進行分析，結果顯示，在過表達轉基因株系OE3中，D2、D11、OsBR6ox、OsBRI1、OsBZR1及OsBAK1表達均上調，分別為對照植株的3.01、2.28、2.22、3.22、3.65、1.11倍。轉基因株系OE1及OE2中BR合成相關基因OsBR6ox及OsBZR1表達上調，OsBR6ox表達量分別為對照的2.8倍和5.33倍，OsBZR1表達量分別為對照的2倍和1.38倍，其他基因變化不明顯。反義轉基因株系AS1和AS2中OsBR6ox表達上調，分別為對照的1.86倍和2.53倍；D2、OsBZR1及OsBAK1表達下調，D2表達量為對照的63%和41%，OsBZR1為對照的82%和55%，OsBAK1表達量為對照的59%和50%，其他基因變化不明顯（圖8）。

3 討論與結論

水稻株高作為重要的農藝性狀之一，其研究一直備受國內外同行關注。水稻黑條矮縮病作為病毒性病害，可導致植株極度矮化、結實率降低甚至不育，嚴重影響水稻生產。我們在對感病材料進行高通量測序及表達譜分析基礎上，篩選到一個表達差異基因OsDWARF48（LOC_Os04g48200），在感病材料中其表達明顯上調（Log2Ratio=8.28），KEGG分析將該基因歸為油菜素內酯合成途徑。

OsDWARF48基因編碼蛋白序列分析顯示，其含有典型的CYP450保守序列，包括在C末端含有血紅素結合區域（FXXGXRXCXG），這個區域在所有CYP450蛋白家族中高度保守并且被作為鑒定CYP450蛋白的主要特征[20，21]；其還有與氧結合和激活相關的PXRX區域以及EXXR區域，這兩個區域對于固定血紅素和維持蛋白核心結構的穩定性是必須的[22]；其N末端含有一個跨膜區，顯示該蛋白為膜結合蛋白，緊鄰此區域有一段富含脯氨酸（Pro）的區域，該區域存在于所有典型的CYP450蛋白中[23]。結構分析表明OsDWARF48基因編碼典型的CYP450蛋白。同源比對分析顯示，OsDWARF48編碼蛋白與CYP87A3同源性較高，為CYP87A3樣蛋白。

OsDWARF48具有組成型的表達模式，顯示該基因在植物生長各階段，尤其是植物胚的形成及發育中發揮作用。結合OsDWARF48編碼蛋白與水稻中參與生長素響應的OsCYP87A3蛋白具有一定的序列同源性[24]，推測OsDWARF48可能通過對植物激素產生響應從而行使功能。BR處理下OsDWARF48的表達受到明顯抑制，顯示該基因可能受BR的負反饋調節。以往研究表明，許多BR合成相關基因如D2、CYP90C1/D11、OsDWARF4等也受到BR的負反饋調節[25-27]。說明BR在植物體內存在較精細的調控機制，當細胞內BR含量過高時，植物一方面通過代謝途徑降解部分BR，另一方面則通過負反饋機制降低BR合成速率，從而達到維系植物體內激素含量動態平衡的目的[28]。

以往報道BR缺失突變體均表現為株高降低，并可通過外施BR得以部分恢復。如OsDWARF4參與水稻BR合成，其突變體株高略矮于對照[27]。OsBR6ox編碼BR-6氧化酶，該酶突變后導致莖稈嚴重矮化，株高只有10～30 cm[29]。D11編碼BR生物合成的一個關鍵酶，其突變會引起植株矮化，而過表達該基因則表現為籽粒變大，產量提高[30]。本研究中，OsDWARF48反義轉基因株系株高降低，檢測顯示OsDWARF48基因表達下調，其內源BR、GA和IAA含量均降低，水稻莖的伸長受到抑制，導致水稻變矮；但過表達株系OE1和OE2的株高并未發生明顯變化，對比其內源激素含量發現，OE1和OE2中只有BR含量增加，而GA和IAA含量降低；而在過表達株系OE3中BR、GA和IAA含量均增加，株高也顯著高于對照。綜合以上結果，顯示轉基因水稻株高是由BR、IAA和GA協同控制的，BR在其中可能起到主導作用。

BR合成及代謝等過程均對內源BR含量產生影響，而基因的表達變化對相應生物學過程具有重要調控作用。以往報道BZR1在BR、IAA和GA的交互反應中發揮重要作用，BZR1能夠與生長素信號轉導的調控元件ARF結合，調控其下游多個基因的表達[31]。在擬南芥中的研究證明，BR首先通過抑制GSK3類激酶負調控子部分激活BZR1轉錄因子的活性從而刺激GA合成，GA水平升高導致另一負調控子DELLA蛋白的降解，從而進一步激活BZR1活性調控基因表達來促進植物生長；在水稻中BR通過調控GA合成和代謝調控細胞伸長，但是具體機制還不清楚[32，33]。

本研究對轉基因株系及對照中BR合成及信號轉導相關基因的表達分析顯示，OsDWARF48過表達水稻中OsBZR1表達上調，而在反義轉基因株系中表達略有下降。OsBR6ox在反義和過表達轉基因株系中表達均上調，該基因作為BR合成關鍵基因，調控內源BR的含量，該基因缺失會導致植株嚴重矮化。推測由于BR合成及代謝相關OsBZR1、OsBR6ox等基因的變化，導致生長素、赤霉素信號途徑發生改變，從而引起內源生長素、赤霉素含量變化，對水稻株高產生影響，具體調控機制仍需要進一步解析。

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