水稻突變體庫的構建及部分性狀分析

李臻　王慶國　劉煒　潘教文

摘要：利用不同技術創制突變體是作物遺傳改良和功能基因組學研究的重要途徑。本研究利用強磁場對水稻品種圣稻15進行輻射誘變，在構建水稻突變體庫的基礎上，經多年種植及篩選，獲得93份在性狀上與對照有明顯差異的突變體。其差異表型主要集中在葉色、葉片形態、株高、抽穗期、穗型、粒型等方面。這些材料作為新的種質資源，將有助于水稻功能基因組學的研究及遺傳育種。

關鍵詞：水稻；突變體誘變；葉色；株高；穗型；粒型

中圖分類號：S511.035.2 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0016-07

Abstract Using different technologies to create mutants is an important way to study crop genetic improvement and functional genomics. In this research， rice mutant library of variety Shengdao 15 was generated by the method of electromagnetic mutagenesis. After years of propagation and screening， 93 mutant lines were obtained with significant phenotypic variations compared with the control. The phenotypic differences were mainly concentrated in leaf color， leaf morphology， plant height， heading stage， panicle architecture and grain shape etc. As new gemplasm rescources，the mutants would be contributed to functional genomics research and genetic breeding of rice.

Keywords Rice； Mutagenesis of mutants； Leaf color； Plant height； Panicle architecture； Grain shape

水稻為重要的糧食作物，全世界50%以上人口以水稻為主食。隨著人口增加、耕地面積減少以及環境的惡化，培育高產、優質、抗逆的水稻新型品種對于維護世界糧食安全具有重要意義。突變是遺傳變異的源泉，利用各種物理和化學方法誘變創制水稻新種質并培育新型品種是水稻育種的重要途徑之一。至今，世界上已培育出約500份水稻突變品種[1]，在其它主要農作物中，如小麥、玉米、大豆等，利用各種誘變手段也育成一系列新品種[2]。誘導種子基因變異、培育優質新種質成為作物育種亟待解決的問題。

事實證明，通過誘變可獲得各種農藝性狀、品質、生育期、抗性等性狀優良或具有特異性狀的突變種質資源。同時，構建水稻突變體庫，利用現代分子生物學技術定位、克隆突變基因，分析突變基因作用機理，已成為目前水稻功能基因組學研究的重要任務。在世界范圍內利用T-DNA插入、DS/dSpm標簽、Tos17標簽以及化學和輻射誘變等方法產生了大量水稻突變體[3]。其中主要包括水稻葉形、葉色、穗型、粒型、根系、生育期、株高、抗性等發生改變的突變體。

植物中多種性狀突變體的獲得，為進一步開展遺傳育種及品種培育提供了豐富資源。對利用Ac/Ds標簽系統獲得的矮稈突變體分析發現，一個氧化還原酶蛋白發生了突變，該蛋白可能通過影響GA的合成控制水稻株高[4]。水稻卷葉突變體sll1-fh673遺傳分析表明，該性狀是由基因Os09g23200突變所導致，這為后續研究水稻卷葉的機制奠定了基礎[5]。對秈型恢復系縉恢10號EMS誘變獲得的矮化大粒突變體sdb1遺傳分析發現，控制該性狀的基因定位于4號染色體406 kb的物理范圍內[6]。類病斑突變體spl34株高變矮， 穗長變短， 穗粒數、結實率明顯降低，遺傳及測序分析發現該表型可能是由于候選基因LOC_Os04g56480突變所導致[7]。通過航天誘變育種獲得的穗型突變體cl表現出熟色好、產量高，但花序結構異常，枝梗頂端小穗三粒簇生，BSA性狀定位法初步將該基因定位于6號染色體[8]。水稻的葉色突變體報道比較多，一般認為是由葉綠體發育異常或者是葉綠素合成或降解過程發生變異所導致，據統計水稻中與葉綠素含量相關的基因超過130多個[9]。對于這些突變體的研究不但有利于揭示突變性狀的相關分子機制，而且有利于提升對水稻育種遺傳機理的研究，提高水稻育種效率。

電離輻射作為一種高能物理損傷因素，可通過電離激發產生大量自由基，引起直接受照的生物組織和細胞損傷。用E≥50 kV/cm的強電場對種子進行處理，實現“電子剪刀”的作用，可以打斷分子間所有的化學鍵，成為單分子物質，同樣也可以使基因斷裂、重組，從而使植物種子產生基因突變。本研究利用強磁場輻射誘變水稻品種圣稻15，獲得一系列穩定的遺傳突變體。這些材料的獲得不但為水稻的遺傳育種提供新的種質資源，而且有助于水稻功能基因組學與遺傳育種的研究。

1 材料與方法

1.1 電磁輻照誘變水稻突變體

以水稻品種圣稻15為材料，選取顆粒飽滿、大小均勻的種子，用E≥50 kV/cm的強電場對濕種子輻照10 min，以未經輻照的種子作為對照。電磁輻照處理由廣東石油化工學院實驗室完成。

1.2 水稻突變體性狀的調查及篩選

將誘變后的水稻M0代種子進行田間種植及擴繁，自M2代開始，在水稻幼苗期、分蘗期、拔節期、抽穗期、灌漿期、成熟期對群體中各材料的株高、葉色、分蘗、葉夾角、抽穗期、穗型、粒型等性狀進行調查，篩選表型差異株系并進行單株收種，以此為基礎進行每年的擴繁及相關性狀調查，直到突變性狀穩定。

2 結果與分析

2.1 水稻突變體的創制

2013年利用強磁場對水稻品種圣稻15進行輻射誘變，誘變種子經田間種植，對M1代進行單株收獲，獲得約2 000多份材料。2014年對收獲的M1代種子進行擴繁，每份材料種20株，對M2代群體表型進行觀察、記錄。篩選出93份表型性狀與對照有明顯變異的材料進行單株收獲（表1），并于2015—2018年連續在田間進行繁種及性狀調查，目前已獲得一批性狀穩定的突變材料。

2.2 部分突變材料的性狀觀察

2.2.1 葉片形態、葉色突變體 圣稻15經強磁場輻射誘變后，篩選到一批葉色、葉片形態發生變異的突變體。其中有3個突變體葉色黃化（編號為M6L1、M6L32和M6L47），特別是M6L1葉片不但黃化，而且植株長勢較弱、分蘗減少（圖1A、B和C）。突變體M6L66的葉片發生了不同程度的扭曲、皺縮，葉脈比較明顯（圖1D）。

2.2.2 株高和株型突變體 在植株高度和形態方面，部分材料也發生了變異。其中突變體M6L48在成熟期株高約為130 cm，而同期對照圣稻15的株高約為105 cm（圖2A）。其它兩個突變體M5W18和M5W19與對照相比植株高度也有明顯增加，尤其是M5W19旗葉高度更為明顯（圖2B和C）。突變體M6L46株高約為140 cm，且成熟期水稻穗型也發生明顯變異，穗型松散，穗長約為對照的1.5倍，穗節間長度明顯增加（圖2D）。同時我們也篩選到一些矮化突變體如M6L13（圖2E），該突變體株高約為50 cm，并且在植株基部葉片上存在明顯的褐色斑點。

2.2.3 抽穗相關突變體 水稻抽穗標志著水稻發育由營養生長到生殖生長的轉變，是決定水稻結實率的關鍵期。輻射誘變對水稻發育有較大影響，產生了一系列抽穗時期改變的突變體，發育的改變也伴隨著植株株高及成熟期的改變（圖3）。M5W1作為較典型的早穗突變體，其抽穗期相比對照提前約20 d，但成熟后結實率降低，株高約為50～60 cm（圖3A）。M5W5抽穗比對照早15 d，株高約為80 cm，成熟早，穗型散（圖3B和圖4C）。M5W10抽穗較早，早熟，而且容易落粒（圖3C）。M5W13抽穗期提前，早熟，早衰（葉色發黃），較易落粒（圖3D）。M6L17苗期長勢弱，抽穗期比較早，株高約為50 cm，結實率低（圖3E）。M6L33葉片稍發黃，抽穗期提前（圖3F）。M6L6抽穗期延遲，葉片顏色較深，葉片略寬（圖3G）。M6L31抽穗期延遲，晚熟（圖3H）。

2.2.4 穗型、粒型突變體 輻射誘變后也產生了部分穗型、粒型發生變異的突變體。其中M5W3穗型較對照細長，粒型比較癟（圖4A）。M6L25穗型與對照相比較細，穗頂部帶芒（圖4B）。M5W5為散穗型，小穗呈分支狀（圖4C、D和E）。M6L22植株比對照高，粒型較對照長（圖4F）。M6L29粒型比較飽滿，粒型圓（圖4G）。M5W15穗及小穗均長于對照，粒型較大，粒較圓（圖4H和I）。

3 討論與結論

水稻是世界上重要的糧食作物，也是發育和遺傳研究的模式植物。水稻突變體的獲得對于研究水稻基因功能、揭示其生長發育的分子機制具有重要意義。

水稻株高和分蘗是組成水稻株型的重要農藝性狀，與植株的光合效率、抗倒伏及產量等密切相關，是影響水稻產量的主要因素。研究表明，水稻株高和分蘗數呈一定程度的負相關性。適當降低作物株高不但能有效防止倒伏，而且能夠一定程度上增加分蘗數，達到單位面積高產穩產的目的。被譽為“綠色革命”的sd-1基因曾在育種上得到廣泛應用，但由于遺傳背景狹窄不但限制了育種工作的發展，而且具有一定的遺傳脆弱性[10，11]。因此，通過不同方式發展水稻矮稈、半矮稈突變體，開展水稻株高相關基因的定位及克隆，從而揭示株高的調控機制對水稻育種具有重要的理論意義和應用價值。目前已發現控制水稻矮稈的基因有80多個，有17個基因已經被克隆。對模式植物擬南芥和水稻株高機制的研究表明，赤霉素GA和油菜素類固醇BR在調控植物的株高方面起著重要作用，主要通過調控GA和BR合成代謝和信號轉導進而調控植株的高度[12， 13]。劉凱等[14]通過EMS誘變獲得遺傳穩定的水稻顯性矮稈突變體Dy，發現突變體Dy具有較強的降株高能力。

水稻的粒型主要由粒長、粒寬和長寬比決定，與水稻品質也有著直接關系，是影響水稻產量和品質的重要因素。目前已有22個控制水稻粒型的基因被克隆，相關調控機制也逐漸被揭示[15]。GS3是第一個克隆到的控制水稻粒長和粒寬的主效基因，編碼一個跨膜蛋白，由四個結構域組成。OSR結構域缺失后會導致粒型變長，而TNFR/NGFR結構域和C端的VWFC缺失導致粒型變短[16，17]。水稻穗型的大小與產量密切相關，也是目前水稻研究的熱點之一。目前已克隆到多個與水稻穗發育相關的基因。DEP1編碼一個類似磷脂酸乙醇胺蛋白，該基因突變為顯性突變，C端230氨基酸的缺失突變導致枝梗數增加、穗變密、穗粒數增加、產量也有所增加[18]。SP1（short panicle1）基因編碼一個多肽轉運蛋白，該基因突變后導致水稻穗型變短，但該基因如何調控穗的發育還需進一步研究[19]。LAX（LAX PANICLE）基因控制穗軸分支分生組織的起始并控制穗的發育，該基因突變后穗分支減少，穗粒數減少[20，21]。

本研究通過對圣稻15進行輻照誘變，篩選到一系列株高、穗型、粒型等農藝性狀發生明顯變異的突變體，為進一步定位、克隆控制相關性狀的基因提供了重要材料。實驗室將在已獲得的突變體基礎上，通過遺傳分析及測序技術，結合生理生化分析，進一步揭示控制水稻株高、穗型、粒型等重要農藝性狀的分子機制，為水稻育種提供新的種質資源，從而推進水稻遺傳育種研究。

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