基于RNAi技術抗黑條矮縮病水稻新品系的培育

朱文銀　徐建第　楊連群　姜明松

摘要：水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）由介體灰飛虱以持久性不經卵方式傳播。該病毒引起的水稻黑條矮縮病分布范圍廣、危害重。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是近年來發現的一種重要的植物抗病毒基因工程策略，已廣泛應用于植物抗病毒研究中。本研究利用已構建的包含P10 CP基因部分片段反向重復序列和生物安全性更高的標記基因bar基因的RNAi雙元表達載體pRBSDV-CP3-bar，采用農桿菌介導轉化水稻愈傷組織獲得抗黑條矮縮病和抗除草劑的轉基因水稻植株，通過抗性篩選、PCR檢測及分子雜交分析，獲得2個抗RBSDV和Basta的穩定品系，并對其田間抗性及農藝性狀表現進行了鑒定，為抗RBSDV水稻新品種（品系）的培育奠定了基礎。

關鍵詞：水稻黑條矮縮病毒；RNA干擾；反向重復序列；農桿菌介導

中圖分類號：S511.035.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0023-05

Abstract Rice black-streaked dwarf virus （RBSDV） is transmitted by the small brown planthopper （SPBH，Laodelphax striatellus Fallen） persistently. Rice black-streaked dwarf disease is one of the most wide spread and severe virus diseases. RNA interference （RNAi） is an important gene silencing phenomenon and has been widely used in the transgenic breeding for improving crops viral resistantce. According to the principle of RNA interference mechanism， a new RNAi binary vector named pRBSDV-CP3-bar， was constructed including the inverted-repeat sequence of P10 CP gene partial fragment and the marker gene bar with higher biosecurity，and was used to transform rice callus mediated by Agrobacterium in order to obtain anti-RBSDV and herbicide-resistant transgenic rice plants. After analyzed by PCR and northern blot，two anti-basta and highly RBSDV-resistant rice varieties KRBSDV2 and KRBSDV6 were obtained.Their performance of field resistance and agronomy traits were investgated. It laid a foundation for the breeding of new rice varieties （lines） resistant to RBSDV.

Keywords Rice black-streaked dwarf virus； RNA interference； Inverted-repeat sequences； Agrobacterium-mediated

水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）是引起水稻黑條矮縮病的病原物，該病毒屬呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟病毒屬（Fijivirus）成員之一[1]。RBSDV主要由昆蟲介體灰飛虱（Laodelphax striatellus Fallen）以持久性不經卵方式傳播，除侵染水稻外，還能侵染玉米引起玉米粗縮病[2]。水稻受該病毒侵染后主要表現為植株矮小叢生，不發棵，葉片細小濃綠，葉背、葉鞘和莖稈有早期蠟白色、后期黑褐色的短條紋不規則突起，嚴重發病株不能正常抽穗。發病田塊一般減產10%～40%，重病田甚至顆粒無收[3-6]。近年來，在黃淮流域粳稻區由于耕作制度和耕種方式的變化，灰飛虱冬前蟲量基數逐年增長，由于田間雜草和禾本科作物可作為RBSDV的寄主，通過灰飛虱的食毒和傳毒，該病很有可能在黃淮流域粳稻區大發生，對水稻生產構成新的威脅。江蘇、山東、河南等省份一直將參試水稻品種的黑條矮縮病抗性鑒定結果作為新品種審定標準的重要約束性指標之一。目前生產上主要依賴化學農藥控制介體灰飛虱來防治RBSDV，但由于灰飛虱的遷飛習性及傳毒的瞬時性，化學防治效果不明顯，且易造成環境污染。因此，選育抗病品種是防治水稻黑條矮縮病最為經濟有效的方法。

RBSDV基因組分子量約占病毒粒子總分子量的15%～20%，其由10條雙鏈RNA（double strand RNA， dsRNA）片段組成，按照其在聚丙烯凝膠電泳上的遷移距離由小到大，依次命名為S1—S10[7]；S1—S10編碼蛋白功能已經基本明確，主要是RNA 依賴的RNA 聚合酶、外殼蛋白、沉默抑制子等[8-10]。其中，S10編碼的63000蛋白質（P10）為病毒主要外層衣殼蛋白（coat protein， CP）。P10蛋白質在體外或酵母細胞內都能通過N端230個氨基酸相互作用形成多聚體。進一步研究結果表明，純化的P10蛋白在溶液中主要形成三聚體。P10蛋白形成三聚體的結構對于RBSDV病毒粒體衣殼的組裝、復制及病毒傳播具有重要作用[11]。

在種質資源抗性篩選中，目前尚未發現對RBSDV病毒免疫的水稻材料。雖然少數水稻資源具有一定抗性，但由于微效基因作用效應低，難以在水稻育種中利用[12]。若用常規方法培育抗病品種存在育種周期長、效率低，抗病基因與不良性狀連鎖等問題。隨著分子生物技術的發展，利用基因工程技術改良現有作物、賦予作物對病毒的抗性，在植物抗病毒病工程中將發揮巨大作用，其中利用較多的是RNA干擾（RNA interference， RNAi）技術，利用該方法能髙效、特異性地控制病毒病。

RNAi是指外源性或內源性雙鏈dsRNA特異性結合并降解靶標基因mRNA，從而達到沉默靶標基因的效果，致使相應的功能表型缺失[13，14]。RNAi的本質是轉錄后的基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS），發生沉默的基因轉錄仍然正常進行，但轉錄的mRNA在細胞質中發生了序列特異性降解，從而導致基因不能正常表達成蛋白質[15]。dsRNA的形成存在多種可能的途徑，許多研究表明，在植物體內產生dsRNA的最佳方法是轉化具有發夾結構RNA（hair-pin RNA，hpRNA）的外源基因，根據RNA干擾原理，發夾結構中的dsRNA將會介導靶標基因mRNA降解，從而實現對靶標基因表達的抑制，使植株獲得病毒抗性。

RBSDV的CP基因編碼病毒的外殼蛋白，主要負責病毒顆粒組裝、復制等功能。本研究利用已構建的包含CP基因部分片段（CP基因3′端部分序列，不編碼任何蛋白）的反向重復序列和bar基因（抗除草劑Basta）的RNAi雙元表達載體pRBSDV-CP3-bar，通過農桿菌介導轉化水稻成熟胚獲得抗黑條矮縮病和抗除草劑的轉基因水稻植株，經抗性鑒定、PCR檢測及Southern blot、Northern blot分析，篩選到穩定的轉基因水稻抗性株系且田間農藝性狀表現良好，為抗RBSDV水稻品種（品系）的培育奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及植物材料

帶RBSDV病毒的灰飛虱成蟲來自濟寧市魚臺縣麥田，用感病品種武育粳3號的幼苗（2～3葉期）飼養，飼養溫度為25～27℃，光照周期 16L∶8D。

轉基因受體品種為圣稻14，屬早熟中粳水稻品種。該品種高感黑條矮縮病，由本研究室保存。

1.2 菌株與試劑

本試驗所用生物工程菌株包括大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α及農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株EHA105，均由本實驗室保存。

植物表達載體pRBSDV-CP3-bar及探針由山東農業大學朱常香教授惠贈，包含CP基因部分片段反向重復序列、水稻PLD（phospholipaseD）基因的內含子和標記基因bar基因（圖1）。

PCR所用dNTPs、Taq DNA 聚合酶、HindⅢ、核酸標準分子量（DL 2000 Plus、DNA Ladder Mix）均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；Trizol購自 Invitrogen 公司、HybondTM-N+、Northern blot kit購自Roche；其他試劑除文中另有注明外，均為國產分析純或化學純。

1.3 遺傳轉化及抗性篩選

通過農桿菌介導法將陽性克隆載體pRBSDV-CP3-bar轉入受體品種圣稻14中。參照姚方印等[16]的方法進行水稻成熟胚愈傷誘導，將誘導出的愈傷組織與已有的陽性農桿菌菌液共培養后，用15 mg/L Basta進行3次抗性篩選，經誘導及分化，最后獲得陽性轉基因植株。

1.4 轉基因水稻總RNA與基因組DNA提取

利用傳統Trizol法提取水稻葉片總RNA，cDNA的合成參照楊杰等[17]的方法進行。DNA提取采用CTAB法，參照Murray等（1980）[18]的方法進行了部分改動。

1.5 轉基因植株PCR分析

根據已發表的RBSDV的S10信息，其中CP基因在GenBank中注冊號為JN008880.1，蛋白注冊號為AEQ75482.1。我們在CP基因3′端附近設計引物（上海英俊生物技術公司合成），以轉化植株基因組DNA為模板進行PCR擴增，目的片段RBSDV-CP3為CP基因的部分序列，因整個全序列形成發夾結構，擴增困難，所以僅擴增hpRNA的莖部分序列。目的片段擴增長度為500 bp，引物序列為：RBSDV-CP3-F：5′-AAGTGCCACTAGTACTTCAAC-3′；RBSDV-CP3-R：5′-TTAATAGCCTGTCCCTATCAG-3′。

PCR 擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環；72℃延伸7 min；4℃保存。

1.6 轉基因植株的 PPT 抗性檢測

水稻分蘗中期，于天氣晴朗時用棉簽蘸取濃度為1 g/L的除草劑Basta（有效成分PPT）涂抹轉化植株葉片長度1～2 cm，7 d后觀察葉片涂抹處是否黃化，鑒定轉化植株是否成功轉入目的基因。

1.7 黑條矮縮病抗性人工接種鑒定

轉基因植株的黑條矮縮病抗性人工接種鑒定參照周彤等[19]的方法進行：帶毒灰飛虱循回時間為12～15 d，接種時間48～72 h，水稻接種苗齡0.5～2.5葉，有效接種強度4～20蟲/苗。根據發病率評價田間抗性水平。分級標準參照水稻條紋葉枯病抗性評價標準。免疫：發病率為零；高抗：發病率0.1%～5%；中抗：發病率5.1%～15%；中感：發病率15.1%～30%；感病：發病率30.1%～50%；高感：發病率大于50%；后四個級別統一記為感病。

1.8 抗病轉基因植株的Southern blot分析

將提取的總DNA經Hind Ⅲ酶切后，轉移到HybondTM-N+尼龍膜，80℃固定2h。Southern雜交分析參照Sambrook等[20]的方法進行。以RBSDV-CP3基因和bar基因為探針，采用隨機引物法合成，用[α32P]dCTP進行標記。

1.9 轉基因植株的Northern blot分析

對提取的轉基因植株總RNA 進行Northern blot分析，參照朱俊華等[21]的方法。

1.10 農藝性狀調查

待水稻成熟期對野生型植株和篩選到的抗性轉基因株系的產量相關性狀如株高、穗長、有效穗數、每穗實粒數、結實率、千粒重進行調查，再用SPSS軟件對結果進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 T0代轉基因植株的Basta鑒定和PCR檢測

待遺傳轉化獲得的轉基因苗生長至6葉期，在葉片上涂抹除草劑Basta，7 d后調查顯示：共有9株呈陽性。用設計的引物進行PCR檢測，以野生型圣稻14為陰性對照，結果顯示，Basta鑒定表現為陽性的植株均可擴增出500 bp的目的片段（hpRNA的莖部分），而野生型圣稻14中未擴增出特異帶（圖2）。表明經除草劑鑒定為陽性的轉基因植株PCR均呈陽性，說明外源基因已整合到圣稻14的染色體基因組中。

2.2 T1代轉基因植株的RBSDV抗性檢測

轉化pRBSDV-CP3載體的T0代陽性植株自交結實，獲得T1代株系，利用葉片涂抹Basta 的方法，篩選出T1代陽性轉基因植株。每個株系各選取50株陽性植株，用帶毒灰飛虱接種RBSDV，以野生型圣稻14為對照。接種30 d后的調查結果顯示，有2個轉基因株系的RBSDV發病率在5%以下，遠低于對照和其它轉化株系的發病率，表現為抗性株系（表1）。

2.3 抗病轉基因植株的Southern blot分析

提取抗病轉基因植株KRBSDV2、KRBSDV6和野生型圣稻14的總DNA，經HindⅢ酶切后，電泳，轉移到尼龍膜上，分別用RBSDV-CP3基因和bar基因為探針，進行Southern雜交。雜交結果（圖3）顯示，野生型圣稻14無任何雜交條帶，而KRBSDV2出現1條雜交帶，KRBSDV6出現2條雜交帶，表明外源基因已整合于水稻的基因組中，且在KRBSDV2中至少存在1個拷貝，在KRBSDV6中至少存在2個拷貝。此外，我們對獲得的這兩個轉基因水稻抗性株系加代，分別檢測了RBSDV-CP3基因和bar基因在這兩個轉基因植株后代群體中遺傳分離情況。結果表明，在所選擇的轉基因植株中，外源基因在轉基因水稻中遵循孟德爾遺傳分離規律，表明外源基因在轉基因植株中能穩定地遺傳和表達。

2.4 T2代轉基因的Northern blot分析

為了分析轉基因植株中的靶基因在轉錄水平上的表達和積累情況，以未接種病毒的野生型水稻作為對照，提取抗病和感病的轉基因植株葉片總RNA，分別用RBSDV-CP3基因和bar基因為探針，進行Northern blot雜交。結果（圖4）顯示：轉基因植株均顯示特異性的雜交信號，而對照野生型水稻中沒有檢測到任何雜交信號。同時發現，在RNA上樣量相等的情況下，抗病轉基因植株中RNA的積累量明顯低于感病植株中RNA的積累量，表明轉基因植株對病毒的抗性與靶基因mRNA的積累量呈負相關。由此說明，轉基因植株所產生的抗病性是由RNA介導的，也暗示了病毒的復制在轉基因植株中受到明顯抑制，即病毒RNA可能發生了降解。

2.5 轉基因品系農藝性狀分析

對轉RBSDV-CP3的兩個穩定株系KRBSDV2、KRBSDV6的農藝性狀進行分析，結果表明，兩個抗病株系與受體圣稻14在株高、穗長、有效穗數、每穗實粒數、結實率、千粒重等6個性狀上無顯著差異（表2）。說明這兩個轉基因株系除抗病性較對照圣稻14有很大提高外，其它農藝性狀較圣稻14相近，具有應用于實際生產的潛力。

3 討論與結論

RNAi是一項高效沉默目的基因干擾特定生命過程的有效技術，作為新興的基因阻斷技術具有明顯的優勢，已被廣泛應用到動植物功能基因組和植物抗病研究中。Hayakawa等[22]將水稻條紋葉枯病毒（Rice stripe virus， RSV）外殼蛋白CP基因導入水稻，結果發現轉基因水稻對RSV有一定抗性。Shimizu等[23]對RBSDV基因組分P9-1進行干擾，發現可以達到抗病效果。基于同樣原理，本研究利用已構建的包含P10 CP基因部分片段反向重復序列和生物安全性更高的標記基因bar基因的RNAi雙元表達載體，通過農桿菌介導方法轉化水稻愈傷組織并獲得抗黑條矮縮病和抗除草劑的轉基因水稻植株。利用其育成的高代抗性株系的重要農藝性狀與野生型無明顯差異，可為抗黑條矮縮病水稻新種質的創制提供了很好的研究基礎。

參 考 文 獻：

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