番茄環紋斑點病毒侵染辣椒揮發物成分分析及對西花薊馬行為反應影響

鄭雪　陳勇　鄭立敏　鄭寬瑜　趙立華　陳永對　張潔

摘要：本試驗以辣椒為寄主植物，研究西花薊馬對番茄環紋斑點病毒侵染辣椒后的行為反應，比較分析病毒侵染前后辣椒揮發物的異同。研究發現，與模擬接毒辣椒相比，西花薊馬偏好選擇機械接毒辣椒，但在產卵量上二者沒有顯著性差異。從模擬接毒和帶毒辣椒植株揮發物中共收集26 種化合物，含量差異顯著的物質有14種。結果表明，西花薊馬對機械接毒辣椒植株有一定的偏好，番茄環紋斑點病毒侵染能誘導辣椒植株揮發物種類和含量的變化。

關鍵詞：番茄環紋斑點病毒；西花薊馬；辣椒；行為反應；揮發物

中圖分類號：S433.89 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2018）11-0111-05

Abstract The effects of Tomato zonate spot virus （TZSV） infection on plant attractiveness for Frankliniella occidentalis and the volatile compounds of the treated plants （infected and non-infected by TZSV） were studies. The results showed that F. occidentalis was more likely to select TZSV-infected pepper plants， whereas there was no significant difference between TZSV infected and non-infected pepper plants in the fecundity of F. occidentalis. Twenty-six types of compounds were identified from the treated pepper plants， and 14 types had significant difference between the two kinds of treated plants. In conclusion，TZSV-infection could alter the varieties and content of host volatile compounds， resulting in attracting thrips vector.

Keywords Tomato zonate spot virus； Frankliniella occidentalis； Pepper； Behavioral responses； Volatile

番茄斑萎病毒屬病毒（Tospoviruses）在全球廣泛分布，為害除禾本科之外的幾乎所有糧食作物、蔬菜及觀賞植物，每年在全球造成數十億美元的經濟損失。2008年在云南番茄上分離得到番茄環紋斑點病毒（Tomato zonate spot virus， TZSV），其在形態學、細胞病理學及基因組結構方面具有布尼亞病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）病毒典型的特征，屬于西瓜銀色斑駁病毒（Watermelan silver mottle virus， WSMoV）血清組成員[1]。近幾年，TZSV在云南多個地區暴發流行，對煙草、番茄、辣椒等經濟作物的生產構成了嚴重威脅[2， 3]。前期研究表明，西花薊馬是TZSV的主要傳播介體之一。西花薊馬是本世紀初侵入我國的生物，隸屬于纓翅目（Thysanoptera），薊馬科（Thripidae），花薊馬屬（Frankliniella）。在昆蟲與植物協同進化過程中，植物次生代謝產生的揮發性物質在它們之間的化學通訊中起著決定性作用，誘導著昆蟲產生寄主定向、逃避、取食和選擇產卵場所、聚集等行為[4-6]。

機械損傷、昆蟲取食、植物病毒侵染等因素均可導致寄主植物產生一系列的生理生化反應，最終致使代謝產物發生改變[7， 8]，這些變化可能會對媒介昆蟲產生有利或不利的影響，從而構成了媒介昆蟲-病毒互作的內在植物生理學基礎。作為病毒傳播介體的寄主植物，其體內病毒誘導作用的變化在植物病毒的傳播及流行過程中起著至關重要的作用。植物病毒侵染會導致寄主植物揮發物成分、含量、植物激素、接毒、防御等相關酶活性發生改變，或對植物感知昆蟲危害并啟動相應的防御反應產生干擾，從而影響媒介昆蟲對寄主植物的選擇性及適合度[9， 10]。

研究寄主植物揮發性次生物質的組成成分、特性、對昆蟲的作用機理以及昆蟲對植物揮發物的行為反應，將有助于闡明昆蟲對寄主植物的選擇機制。目前，關于蟲害誘導的植物揮發物對昆蟲影響的研究較多，主要集中在揮發性信息化合物的鑒定及功能的分析。有研究表明蟲害誘導植物產生的揮發物對天敵有引誘作用，并且對部分植食性昆蟲有排斥作用[11-13]；但也有研究表明，植物揮發物亦是很多植食性害蟲尋找寄主植物的指示信號[14， 15]。

目前，關于植物病毒侵染導致寄主植物揮發物的改變對媒介昆蟲影響的報道較少。鑒于此，本試驗就番茄環紋斑點病毒侵染寄主植物辣椒后釋放的植物揮發物對媒介昆蟲西花薊馬行為反應的影響進行研究，并對TZSV侵染后的寄主植物辣椒揮發物的成分進行鑒定分析，以期為進一步闡明植物病毒-寄主植物-媒介昆蟲三者互作關系提供行為學證據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試昆蟲：西花薊馬采自云南省昆明市晉寧蔬菜大棚，實驗室鑒定后用四季豆繼代培養。飼養條件：（25±1）℃、相對濕度為70%～80%、16 h光照。

毒源：感TZSV的寄主植物番茄于2012年采自云南省元謀縣，經RT-PCR檢測后于-80℃條件下保存。

供試寄主植物：3～4片真葉期辣椒苗（辣椒種子為遵辣一號，由遵義市農業科學院園藝所惠贈）于人工氣候箱內[（25±1）℃ ，16 h光照]培育。模擬接毒處理：僅用蒸餾水涂抹至健康辣椒上。機械接毒處理：將毒源通過摩擦接種方法接毒至健康辣椒苗上，獲得感染TZSV植株（PCR檢測帶毒后供試）。

1.2 番茄環紋斑點病毒對介體昆蟲西花薊馬選擇行為的影響試驗

采用玻璃Y型嗅覺儀測定介體西花薊馬對感染TZSV辣椒葉片的選擇行為。Y型嗅覺儀臂長20 cm，內徑1 cm，兩臂夾角60°，管柄長15 cm，管柄上離夾角10 cm處連有5 cm長的釋放管。每管用硅膠管分別連接一味源瓶（250 mL帶磨砂口的容量瓶，分別內置感染TZSV的辣椒葉片和健康葉片），進入味源瓶的空氣經活性炭過濾后再進入蒸餾水加濕瓶，以凈化和增加空氣濕度，管柄處接入真空泵，調節抽氣速率為100 mL/min。試驗在遮光的室內進行，頂燈為1盞15 W的熒光燈，測試環境室溫為（25 ± 2）℃，濕度70% ～ 75%。

行為測定方法：挑選50頭健康活潑并經過饑餓處理4 h的西花薊馬成蟲，接到Y型管基部，觀察其5 min內的行為選擇反應，當西花薊馬越過某一側臂的1/3并做一定時間的徘徊停留，則視為選擇，5 min內未進入任何側臂，則記為無選擇，被排除在統計分析外。試驗重復3次，每次重復調換Y型管方向并用95%乙醇擦洗Y型管，烘干以消除味源殘留。記錄進入兩臂內西花薊馬的數量。

1.3 番茄環紋斑點病毒對介體昆蟲西花薊馬產卵行為的影響試驗

取20頭同期剛羽化的西花薊馬雌成蟲，單頭飼養于放有模擬接毒和機械接毒辣椒葉碟的培養皿中任其孤雌生殖產卵，將培養皿置于人工氣候箱內[（25±1）℃，16 h光照）]。每天記錄孵化出的西花薊馬若蟲數量，至成蟲死亡，顯微鏡觀察葉碟中未孵化卵數。每2天更換一次放有模擬接毒和機械接毒辣椒葉碟。試驗重復 5次。

1.4 寄主植物揮發物的提取和鑒定

分模擬接毒和機械接毒辣椒植株2個處理。試驗在室溫下進行。

各處理稱取15 g完整新鮮的葉片、莖干樣品，分別置于100 mL的采樣瓶中，瓶口用封口膜密封，待用。采樣瓶不能被裝滿，需預留頂空萃取空間。安裝萃取頭到手動進樣手柄。100 μm PDMS萃取頭和65 μm PDMS/DVB萃取頭均在250℃下老化30 min（首次使用前需要老化）。用固相微萃取裝置刺穿封口膜，插入采樣瓶中，固定手柄高度后，推出萃取頭，在頂空萃取30 min。快速移出萃取頭立即插入氣相色譜儀進樣口中，熱解析5 min進樣，進行GC-MS分析。GC-MS分析條件[16]為毛細管柱：極性柱DB-5MS，膜厚0.25 μm，長30 m，內徑0.25 mm；氣譜條件：程序升溫，45℃保持3 min，每分鐘升溫5℃，至230℃，保留5 min；氦氣流速為1 cm/s。每次進樣1 μL。進樣口溫度230℃，連接線溫度180℃。不分流進樣。數據處理：采用標準譜庫和標樣對照的方法對揮發物組分進行定性，用揮發物的峰面積進行相對定量比較。采用質譜庫檢索寄主植物的揮發物成分進行結構鑒定。

2 結果與分析

2.1 番茄環紋斑點病毒對介體昆蟲西花薊馬選擇行為的影響

Y型嗅覺儀器測試表明，TZSV對薊馬的選擇偏好性有較大影響（表1）。面對模擬接毒和機械接毒后寄主植物辣椒散發的不同氣味源，約13.4頭的西花薊馬選擇模擬接毒的辣椒，所占比例為26.8%，選擇機械接毒辣椒的西花薊馬數量高達32.2頭，占比達64.4%，二者之間均達到顯著性差異。結果表明感染TZSV植株（機械接毒）散發的氣味源對西花薊馬有較強的吸引作用，有利于西花薊馬獲毒，促進病毒傳播。

2.2 番茄環紋斑點病毒對介體昆蟲西花薊馬產卵行為的影響

由表2可以看出，模擬接毒與機械接毒的辣椒葉片對西花薊馬產卵量沒有顯著影響，分別為24.20頭和24.76頭。

2.3 番茄環紋斑點病毒侵染對寄主植物辣椒揮發物成分及含量的影響

由表3可以看出，模擬接毒和機械接毒兩組處理共檢測出26種揮發性物質，含量差異顯著的物質有14種。其中，（z）-3-已烯醛、（e）-2-已烯醛僅在機械接毒辣椒中檢測到，而（e）-β-羅勒烯僅在模擬接毒處理中檢測到。

模擬接毒和機械接毒兩處理揮發物含量最高的兩種化合物均為β-水芹烯和（Z）-3-己烯-1-醇，該兩種化合物總量均超過各自處理組的50%，揮發物含量排在第3 位的均為（+）-2-蒈烯。除此之外，其余單種化合物的含量均低于5%，但間傘花烴、α-水芹烯、2-乙基-呋喃、二甲基硫醚、α-蛇麻烯、1-戊烯-3-醇、正戊醇、（z）-1， 5-二烯-3-醇、異戊醛在模擬接毒和機械接毒兩組處理中的含量存在顯著性差異。

3 討論與結論

植物揮發性次生物質主要是植物的次生代謝物，這些次生化合物中的大多數對植物正常生長發育并不是很重要，但在植物與昆蟲和螨類等節肢動物相互關系中顯得非常重要，是形成植物氣味特征物質的主體。在昆蟲與植物協同進化過程中，植物次生代謝產生的揮發性物質在他們之間的化學通訊中起著決定性作用，在昆蟲尋找識別寄主植物、產卵等過程中具有重要的通訊引導作用，揮發性物質在每種寄主植物中的成分、含量不盡相同，但主要包括烴類、醇、醛、酮、酯、有機酸和萜烯類等幾類化合物[17]。

昆蟲對不同植物的取食或產卵選擇是昆蟲與植物長期協同進化過程中形成的重要生存策略，植食性昆蟲可利用植物傳達的信息通過嗅覺或者結合視覺共同識別寄主植物[18]。植物在遭受損傷或被昆蟲、微生物侵染后，作為一種直接或間接的防御信號，其揮發物的組成會產生明顯的變化，從而影響植食性昆蟲的行為。有研究表明，寄主植物在感染Tospoviruses代表種番茄斑萎病毒（TSWV）后，可以大量吸引介體薊馬到感病植物上取食[19]。本研究發現，與模擬接毒的辣椒相比，64.4%的西花薊馬選擇帶毒植株，選擇模擬接毒辣椒的西花薊馬僅占26.8%，表明TZSV機械接毒至辣椒植株對西花薊馬有明顯的引誘作用，與Abe等[19]的研究結果相同。中國番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl China virus， TYLCCNV）和煙草曲莖病毒（Tobacco curly shoot virus， TbCSV）的侵染會導致傳毒介體B型、ZHJ1兩種生物型的煙粉虱在煙草和棉花上的平均產卵量顯著增多[20]，在本研究中，西花薊馬在模擬接毒的試驗組中產卵量稍低于在機械接毒辣椒葉片上的產卵量，但二者之間沒有顯著性差異。造成這種差異的原因可能與寄主植物、不同種類病毒侵染后釋放的揮發物和媒介昆蟲不同有關。

本研究兩組處理共鑒定出26種揮發性物質，其中模擬接毒組檢測到24種，機械接毒組檢測到25種，兩組處理揮發物均以β-水芹烯和（Z）-3-己烯-1-醇為主要成分，該兩種化合物總量均超過各自處理組的50%。與模擬接毒處理相比，機械接毒處理組揮發物成分新增加了（z）-3-已烯醛和（e）-2-已烯醛兩種成分，這與蟲害誘導的植物揮發物具有很高的多樣性和可變性的規律相似[15]，且間傘花烴、（+）-2-蒈烯、α-水芹烯、α-蛇麻烯等成分含量顯著上升，2-乙基-呋喃、二甲基硫醚、1-戊烯-3-醇、正戊醇、（z）-3-己烯-1-醇、（z）-1， 5-二烯-3-醇和異戊醛的含量顯著下降。有研究表明，大多數植物遭遇蟲害后均會釋放萜烯類化合物，通過頂空抽樣分析發現，與健康野生型番茄植株相比，受害野生型植株誘導了大量的揮發物產生，主要是萜烯類，包括 α-蒎烯、β-蒎烯和2-蒈烯等[11]，與本研究結果類似。萜烯類是很重要的植食性昆蟲誘導的植物抗性物質，機械接毒后的辣椒植株誘導新增加了（z）-3-已烯醛和（e）-2-已烯醛，（+）-2-蒈烯、α-水芹烯和α-蛇麻烯的相對含量則明顯增加，這可能與辣椒植株受病毒侵染后啟動了自身相應的防御反應有關。

植物病毒作為農田生態系統的關鍵因子之一，對寄主植物和植食性昆蟲有重要的影響，其誘導寄主植物揮發物在引誘或驅避害蟲中的關鍵作用需要深入探討，對于誘導途徑還需從分子水平上揭示其機理。

參 考 文 獻：

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