黃連素通過ROS/ERK1/2通路抗幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎的實驗研究※

● 田 華 閆平慧 張鋒利

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori，HP)是一種能感染人類胃部的革蘭陰性微需氧菌，是最常見的傳染性病原菌之一[1]，全球有超過50%的人群感染，我國的平均感染率高達56%[2]。幽門螺旋桿菌相關(guān)性胃炎是指與HP感染相關(guān)的胃黏膜急慢性炎癥或萎縮性病變[3]。目前研究證明，HP感染后可激發(fā)機體發(fā)生氧化應(yīng)激(ROS)反應(yīng)，生成的超氧化物(Superoxide，O2-)、一氧化氮(Nitric Oxide，NO)等是造成胃黏膜持續(xù)性損傷，導致胃炎甚至癌癥發(fā)生的重要因素[4-5]。ERK1/2是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，是促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中成員之一。它磷酸化后激活，激活的ERK1/2介導多種生物學反應(yīng)[6-7]。大量研究證明，ROS是導致ERK1/2磷酸化的重要激活劑[8]，而ERK1/2激活后又加劇了ROS對胃黏膜的損傷，抑制了胃黏膜的修復(fù)，引起急慢性胃炎，甚至出現(xiàn)細胞的過度增殖分化[9]。

黃連素(berberine，[C20H18NO4]+，又稱小檗堿，BBR)是從毛莨科植物黃連、黃柏根莖中提取出的一種異喹啉類生物堿。它外觀呈黃色的針狀結(jié)晶或粉末，無臭、味極苦，由于它具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抗氧化應(yīng)激損傷等多種藥理作用而被廣泛應(yīng)用于臨床[10-11]。

該實驗建立大鼠HP相關(guān)性胃炎模型，觀察黃連素對HP相關(guān)性胃炎胃黏膜的保護作用，并從抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)ERK1/2表達方面探討黃連素抗HP相關(guān)性胃炎胃黏膜的損傷、保護胃黏膜的作用機制，為黃連素防治HP相關(guān)性胃炎的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1動物成年雄性SD大鼠(220～240g)48只，購自西安交通大學實驗動物中心[許可證號：SCXK(陜)2012-003]。實驗室飼養(yǎng)溫度(20±2)℃，所有動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2藥品與試劑黃連素(B3251 Sigma)、快速尿素酶試驗試劑盒(安信生物技術(shù)有限公司，批號：141196)、NOX2(sc-5827)、NOX4(sc-21860)、SOD(sc-17767)、ERK1/2(sc-16982)和iNOS(sc-5302)抗體均購自美國的Santa Cruz Biotechnology。

1.3儀器光學顯微鏡(尼康DXM1200F)，倒置顯微鏡(尼康TS100)，低溫恒冷切片機(KD2800)，臺式高速離心機(GENIUS 16K)，脫水機(TP1020)，烘片機(ZMN200)，石蠟切片染色機(5010型)，微波爐，高壓鍋，恒溫水浴箱，WB機(Bio-Rad，USA)。

2 方法

2.1造模48只大鼠隨機分成正常組、正常+黃連素組、模型組、模型+黃連素組，每組各12只。參考文獻[12]對模型組及模型+黃連素組大鼠進行造模。造模大鼠禁食12小時后以NaHCO3+消炎痛溶液0.5ml/只灌胃，接著禁食6小時后以HP菌液(含量109ml-1)1.5ml/只灌胃，再禁食禁水4h后常規(guī)飼養(yǎng)，隔天一次，連續(xù)10天，之后繼續(xù)常規(guī)喂養(yǎng)；正常組及正常+黃連素組大鼠常規(guī)喂養(yǎng)。4周后，每組隨機處死2只大鼠，取出鼠胃并沿胃大彎剪開，取一半胃黏膜組織做快速尿素酶實驗、黏膜涂片革蘭染色，以判斷胃竇黏膜HP定植情況；取另一半胃黏膜組織，用4%多聚甲醛固定24 h后進行病理組織學檢查。造模組大鼠胃黏膜均出現(xiàn)不同程度炎性改變，正常組的大鼠胃黏膜切片未見胃炎的病理改變。

2.2給藥正常+黃連素組與模型+黃連素組將黃連素用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制成濃度為100mg/ml的混懸液，正常組和模型組用0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，四組均于每天上午9～10時按2ml/(kg·d)體積灌胃，連續(xù)給藥4周。

2.3 Wester Blot檢測取胃組織勻漿后測定蛋白含量，制備SDS-PAGE膠，蛋白變性、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉加一抗過夜，TBST洗膜，二抗封閉，TBST洗膜，發(fā)光。分別測定總ERK1/2、磷酸化ERK1/2、NOX2、NOX4、SOD蛋白的含量。以β-actin作為內(nèi)參，使用Image J分析軟件，計算每一樣本蛋白的相對表達量。

3 結(jié)果

3.1各組大鼠胃黏膜NOX2含量情況模型組大鼠NOX2的含量明顯高于正常組及正常+黃連素組大鼠(P<0.05)；模型+黃連素組的NOX2含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+黃連素組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 大鼠胃黏膜NOX2含量

3.2各組大鼠胃黏膜NOX4含量情況模型組大鼠NOX4的含量明顯高于正常組及正常+黃連素組大鼠(P<0.05)；模型+黃連素組NOX4含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+黃連素組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖2、表1。

圖2 大鼠胃黏膜NOX4含量

3.3各組大鼠胃黏膜iNOS含量情況模型組大鼠iNOS的含量明顯高于正常組及正常+黃連素組大鼠(P<0.05)；模型+黃連素組的iNOS含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+黃連素組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖3、表1。

圖3 大鼠胃黏膜iNOS含量

3.4各組大鼠胃黏膜SOD含量情況模型組大鼠SOD的含量明顯低于正常組及正常+黃連素組大鼠(P<0.05)；模型+黃連素組的SOD含量明顯高于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+黃連素組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖4、表1。

圖4 大鼠胃黏膜SOD含量

3.5各組大鼠胃黏膜的磷酸化ERK1/2含量及總ERK1/2含量情況模型組大鼠磷酸化ERK1/2的含量明顯高于正常組及正常+黃連素組大鼠(P<0.05)；模型+黃連素組的磷酸化ERK1/2含量明顯低于模型組(P<0.05)，而與正常組及正常+黃連素組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。各組間總ERK1/2的含量沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見圖5、表1。

圖5 大鼠胃黏膜t-ERK、ph-ERK含量

表1 各組大鼠胃黏膜NOX2、NOX4、iNOS、SOD、t-ERK、ph-ERK蛋白的表達

注：與正常組比較，△P<0.05；與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

幽門螺桿菌是最常見的傳染性病原菌之一，在我國的感染率呈逐年上升的趨勢[2]。HP在胃黏膜上皮細胞表面和胃粘液底層定植，導致胃黏膜細胞發(fā)生變性、壞死并伴有炎癥細胞浸潤，引起急性胃黏膜炎癥，并發(fā)展為慢性胃炎；甚至出現(xiàn)胃黏膜的萎縮、化生，最終導致腺癌形成[13]。研究表明，在HP引起的胃黏膜損傷中，氧化應(yīng)激起了十分重要的作用，感染HP的胃黏膜ROS明顯增加[14]。首先，氧自由基通過與細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸的結(jié)合，形成了大量的脂質(zhì)過氧化物，損害細胞內(nèi)線粒體和溶酶體，引發(fā)胃黏膜血流障礙，導致胃黏膜損傷。其次，氧自由基也可與相關(guān)氨基酸中的巰基結(jié)合使酶失活，從而破壞上皮間質(zhì)透明質(zhì)酸酶和膠原纖維網(wǎng)而進一步損害胃黏膜[9]。超氧化物歧化酶和NAD(P)H氧化酶是常用的反映氧化應(yīng)激反應(yīng)的指標。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物體內(nèi)氧自由基清除的首要防線，它可降低氧化應(yīng)激對細胞膜脂的損害并且修復(fù)受損細胞。因此，常用于考察清除氧自由基能力和胃黏膜保護作用[14]。NAD(P)H氧化酶則是一個多亞基的氧化還原酶，它的激活是組織內(nèi)活性氧簇產(chǎn)生的重要原因之一，其結(jié)構(gòu)中比較重要的有膜成分細胞色素gp91phox(NOX-2)和存在于細胞質(zhì)中水溶性蛋白p47phox(NOX-4)。當HP進入機體后被中性粒細胞迅速吞噬，形成吞噬體，通過NAD(P)H氧化酶系統(tǒng)，增加過氧化物(Superoxide，O2-)、一氧化氮(Nitric Oxide，NO)等產(chǎn)物致使胃黏膜進一步受損[15]。

在氧化應(yīng)激的作用下過多產(chǎn)生的NO，它的生成依賴于一氧化氮合酶，其中誘導型NO合酶(iNOS)被證明在被誘導激活后可產(chǎn)生大量NO，并與過氧陰離子反應(yīng)形成過氧化亞硝酸鹽，引起和加重消化道黏膜的損傷[16]。MAPK信號通路是調(diào)控HP相關(guān)性胃炎發(fā)生的重要通路，ERK作為MAPK下游主要通路，是將細胞外信號轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)部的重要物質(zhì)，可在氧化應(yīng)激、炎癥等多種因素下被激活，活化后移位至細胞核，促進多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而調(diào)控基因表達，促進細胞增殖分化。已有研究證明，ERK通路活性增高不僅可促進胃黏膜細胞的增殖，而且該通路的激活對于胃黏膜的修復(fù)也具有重要意義[8-9]。HP定植胃黏膜后，胃黏膜ROS明顯增加。首先，氧自由基通過與細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸的結(jié)合，形成了大量的脂質(zhì)過氧化物，引發(fā)胃黏膜血流障礙，導致胃黏膜損傷。其次它也激活了ERK通路，將細胞外信號轉(zhuǎn)導到細胞內(nèi)部，促進多種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而調(diào)控基因表達，這又加劇了ROS對胃黏膜的損傷，抑制了胃黏膜的修復(fù)，引起急慢性胃炎，甚至出現(xiàn)細胞的過度增殖分化。

目前，臨床上HP相關(guān)性胃炎的一線治療方案存在毒副作用明顯、療效不穩(wěn)定、易復(fù)發(fā)、病人依從性差、費用高等問題，其中，抗生素的廣泛使用，不但引起胃腸道菌群失調(diào)及功能紊亂等不良反應(yīng)，而且致使HP的耐藥問題日趨嚴重[17]。黃連素由于其具有抗炎、抗氧化、降糖、調(diào)脂、降壓、神經(jīng)保護等多種藥理作用而備受關(guān)注。本試驗結(jié)果表明，黃連素能夠明顯減少HP相關(guān)胃炎大鼠的NOX2、NOX4、iNOS和ph-ERK1/2的表達，提高SOD的表達，從而抑制HP引起的氧化應(yīng)激對胃黏膜的損傷，這為其作為該疾病的防治藥物提供了新的理論和實驗依據(jù)。

[1]Graham DY.Helicobacter pylori Update：Gastric Cancer，Reliable Therapy，and Possible Benefits [J].Gastroenterology，2015，148(4)：719-731.

[2]Kusters J G，van Vliet A H，Kuipers E J.Pathogenesis of Helicobacter pylori infection [J].Clinical Microbiology Reviews， 2006，19(3)：449-490.

[3]Salama NR，Hartung ML，Mu ller A.Life in the human stomach：persistence strategies of the bacterial pathogen Helicobacter pylori[J].Nature Reviews Microbiology，2013，11(6)：385-399.

[4]Kuehler T C，F(xiàn)ryklund J，Bergman N-k，et al.Structure-activity relationship of omeprazole and analogs as Helicobacter pylori urease inhibitors[J].Journal of medicinal chemistry，1995，38(25)：451-480.

[5]賴小平，蘇子仁，陳建南，等.廣藿香醇在制備抗幽門螺桿菌的藥物中的應(yīng)用[P].中國，ZL 201110249038.9.2013-01-28.

[6]Lin Y W，Lee L M，Lee W J，et al.Melatonin inhibits MMP-9 transactivation and renal cell carcinoma metastasis by suppressing Akt-MAPKs pathway and NF-kB DNA-binding activity[J].Pineal Res，2016，60(3)：277.

[7] Martinez-Salgado， C.，F(xiàn)uentes-Calvo， I.，Garcia-Cenador，B.，Santos， E. and Lopez-Novoa， J. M. Involvement of H- and N-Ras isoforms in transforming growth factor-β1-induced proliferation and in collagen and fibronectin synthesis[J]. Exp.Cell Res.2006，312：2093-2106.

[8]Liu S，Mizu H，Yamauchi H.Photoinflammatory responses to UV-irradiated ketoprofen mediated by the induction of ROS generation，enhancement of cyclooxygenase-2 expression，and regulation of multiple signaling pathways[J].Free radical biology & medicine 2010，48：772-800.

[9]蔡泳鋒，連大衛(wèi)，蘇 銳，等.氧化應(yīng)激與幽門螺桿菌感染相關(guān)性胃炎[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展2016，16(27)：5397-5399.

[10]王洪建，王維新，張翠蓮，黃連素的藥理作用和臨床應(yīng)用進展[J].社會醫(yī)學雜志，2006，4(4)：36-38.

[11]郭麗坤，王志榮，岑 戎. 黃連素治療幽門螺桿菌感染的臨床研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志，2013，23(3)：149-151.

[12]姚希賢，姚金鋒.“療胃煎劑”胃黏膜保護作用的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合脾胃雜志，2000，8(3)：330-333.

[13]張 爽，劉海峰，張成崗.應(yīng)激性胃黏膜損傷發(fā)病機制的研究進展.世界華人消化雜志，2009，17(17) ：1697-1701.

[14]Lu T C，Liao J C，Huang T H，et al.Analgesic and Anti-Inflammatory Activities of the Methanol Extract from Pogostemon cablin [J]. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine， Volume 2011， Article ID 671741， 9 pages.

[15]Nam HJ，Park YY，Yoon G，et al.Co-treatment with hepatocyte growth factor and TGF-beta1 enhances migration of HaCaT cells through NADPH oxidase-dependent ROS generation.Experimental [J].Molecular Medicine 2010，42：270-279.

[16]Cherdantseva LA，Potapova OV，Sharkova TV，et al.Association of Helicobacter pylori and iNOS production by macrophages and lymphocytes in the gastric mucosa in chronic gastritis [J].Journal of Immunology research，2014，18：762-766.

[17]張萬傷.中西醫(yī)結(jié)合提高幽門螺桿菌根除率的探討[J].醫(yī)學與哲學，2012，33(5B)：12-13.