酶聯免疫試劑盒檢測雞肉呋喃唑酮代謝物

趙敬翠

（遼寧省朝陽市建平縣畜產品安全監察所122400）

呋喃唑酮是人工合成的硝基呋喃類抗菌藥物，屬于廣譜抗菌藥，對常見的革蘭氏陰性菌 （大腸桿菌、沙門氏菌）和陽性菌有抑制作用，對真菌、原蟲等也有很好的殺滅效果，可用于治療細菌和原蟲引起的痢疾、腸炎、胃潰瘍等胃腸道疾患。呋喃唑酮進入動物體內很快被分解，其代謝物有致癌、致畸等作用。中華人民共和國農業部將呋喃唑酮列為禁止使用的藥物，不得在動物性食品中檢出。FDA也于2002年禁止了硝基呋喃類 (包括呋喃唑酮)在動物性食品中的使用。

目前建平縣區常用酶聯免疫吸附法來檢測雞肉中呋喃唑酮代謝物。本文用酶聯免疫試劑盒檢測雞肉中呋喃唑酮代謝物的含量，其原理是待測樣品中的呋喃唑酮代謝物經衍生化后與酶標板上固定的抗原特異性競爭抗體，當樣品中呋喃唑酮代謝物含量少時，更多的抗體就會與酶標板上的抗原結合而被固定在酶標板上，加入酶標記物，催化底物顯色，顏色為深藍色；反之，含量多時，顏色為淺藍色。

1 實驗材料準備

1.1 樣品前處理

在建平縣屠宰廠隨機抽取代表性樣品 （雞肉）40批次，每個樣品取雞腿部肌肉，精確秤取1±0.01g，均質后的樣品于50ml離心管中；依次加入4ml去離子水、0.5ml1M鹽酸和80μl50mM鄰硝基苯甲醛，充分渦動1min至組織充分分散；衍生化1.5h；依次加入5ml緩沖溶液、400μl1M氫氧化鈉和6ml乙酸乙酯，劇烈渦動1min，4000g以上離心 10min，取 3ml上清液于新的離心管中，50～60℃水浴中，氮氣吹干；加入1ml正己烷，再加入1ml樣品稀釋液，高速渦動30s，4000g以上離心5min，完全棄去上層正己烷及中間層雜質或小心吸取下層清液500μl于干凈離心管中；取 50μl進行檢測。

1.2 試劑盒及回溫

呋喃唑酮代謝物酶聯免疫試劑盒（II型）購自北京維德維康生物技術有限公司生產。實驗前將試劑盒放于室內恢復至室溫23～27℃。

1.3 陽性對照品的制備

根據標準曲線確定陽性對照濃度為0.2ppb， 取濃度0.81ppb標準品247.0μl添加到1g空白樣品中，成為濃度0.2ppb的陽性對照品，用于計算陽性對照回收率。前處理同前。

2 檢測步驟

（1）取出酶標板，做雙孔平行，記錄標準品、陽性對照品和樣品的位置。

（2）在酶標板孔依次加入標準品、陽性對照品、陰性對照品和其它待測樣品均為50μl。添加不同樣品時需更換槍頭，防止交叉污染。

（3）每孔加入50μl酶標記物工作液，再每孔加入50μl抗體工作液，用蓋板膜蓋好酶標板，輕輕振蕩酶標板10s，避光反應30min。

（4）洗板嚴格按照說明書要求操作。

（5）洗板后拍干，立即在每孔中加入100μl底物A、B混合液。用蓋板膜蓋好酶標板，輕輕振蕩酶標板，避光反應 15～20min。

（6）揭開蓋板膜，每孔中加入50μl終止液，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻。5min內，用酶標儀在雙波長450nm、630nm下讀取酶標板吸光度值，并將數值打印出來。

3 計算陽性對照回收率

利用電腦上r-biopharm數據分析軟件進行結果分析，同時繪制標準曲線并得出所有檢測樣品中呋喃唑酮代謝物的含量。回收率 （%）=（實測陽性對照濃度-實測陰性對照濃度）÷添加濃度 （0.2ppb）×100%，本次檢測回收率為95%，在75～105%范圍內，說明此次檢測和結果準確性高。

4 討論

試劑盒要求貯存溫度為2～8℃，因為抗體和酶標Ⅱ抗在常溫下易變性。

加樣時移液槍應垂直于板孔，防止將液體加在孔壁上部，加不同樣品時要注意更換槍頭，避免交叉污染。

洗板是很關鍵的一步。洗滌次數和每次加液量及間隔時間都要嚴格按照說明書要求操作，使游離的與結合的酶標記物的達到分離目的，確保實驗結果的準確性。

底物A、B混合液嚴格按1：1比例充分混合，必須在5min內使用，不能使用金屬盛裝、攪拌試劑。

目前，酶聯免疫吸附法是我們檢測藥物殘留的常用方法之一。此方法具有方便、快速、靈敏等特點，適用于大批量樣品篩查。