豬繁殖與呼吸綜合征及其免疫防控研究進展

桂紅 （湖南省永州市祁陽縣畜牧水產局 426100）

豬繁殖與呼吸綜合征 （Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）自20世紀80年代在美國爆發以來，給全球養豬業帶來巨大的經濟損失。PRRS由豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （PRRSV）引起，2006年我國爆發的 “無名高熱病”豬病疫情，經診斷為由變異的PRRSV導致，稱為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征 （Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， HP-PRRS）。 與 PRRS 相比，HP-PRRS具有更高的發病率及致死率[1]。感染PRRSV的發病豬表現出四肢和耳部皮膚發紺，故PRRS又稱 “藍耳病”。PRRS能引起妊娠母豬流產、產死胎、木乃伊胎及弱仔等繁殖障礙，仔豬則出現呼吸道疾病[2]。PRRS傳播快、傳染性強，PRRSV感染豬表現出發熱、厭食、呼吸困難，并造成繼發性感染導致豬只死淘率增加，PRRS的頻繁爆發給全球養豬業造成巨大的經濟損失[3]。目前PRRSV/HP-PRRS在我國爆發性流行態勢已得到有效控制，近幾年趨于零散式發展，但在我國各省區依然存在[4]。此外，由于PRRSV具有廣泛變異性和毒株多樣性，對于該病的免疫防控及完全控制依然存在巨大挑戰。

1 病原學

1.1 PRRSV的生物學特性

PRRSV屬尼多病毒目 （Nidovirales），動脈炎科病毒屬（Artevrriidae）[5]，為單股正鏈RNA病毒。PRRSV有囊膜，直徑為45～65nm，病毒粒子呈球形或卵圓形，核衣殼直徑為23～35nm，呈二十面體對稱，其表面有纖突[6]。PRRSV的RNA大約含15000個堿基，含9個開放閱讀框 （Open Reading Frames， ORFs）： ORF1a/1b， ORF2a/2b， ORFs3～7[7]， 每個ORF與相鄰的ORF均發生部分重疊。其中ORF1a/1b編碼RNA復制酶，與PRRSV的復制相關，ORF1a編碼的寡聚蛋白經加工后形成NSP1α、NSP1β、NSP2～5這6種非結構蛋白。ORF2～ORF5分別編碼囊蛋白GP2a/2b、GP3、GP4和GP5[8]，其中GP3是突變性最高的蛋白之一，有一定的抗免疫作用，GP4為RRSV主要結構蛋白，與免疫導向性相關，GP5則與機體產生特異性抗體有關[9]。ORF6編碼膜基質蛋白 （M蛋白），其分子量為18～19kD，M蛋白能刺激T淋巴細胞增生，誘導細胞免疫；ORF7編碼核衣殼蛋白 （N）[10]。

根據基因序列和抗原特性上的不同，PRRSV可劃分為歐洲型 （Ⅰ型）和美洲型 （Ⅱ型）兩個血清型，兩種毒株間僅有大約80%的氨基酸同源性，美洲型為我國主要流行的毒株，但在一些地區也分離到歐洲型毒株[11]。Ⅰ型和Ⅱ型的NSP2蛋白存在很大差異，其氨基酸序列僅有32%的同源性，而變異株HP-PRRSV也是由于PRRSV的NSP2缺失30個氨基酸導致的[12]。ORF5編碼的GP5為PRRSV最容易發生變異的結構蛋白，同時也最具有抗原性。疫苗毒在豬體內增殖過程中，PRRSV基因組選擇性地向強毒株發生突變，且隨著病毒復制時間的延長，其遺傳變異性及抗原變異性均呈現出不斷增加的趨勢，其中ORF5的突變速率最高，其選擇性突變能力也最強。有研究顯示，這一特性有利于PRRSV的免疫逃避[13]。

1.2 PRRSV致病機理

PRRSV對豬肺泡巨噬細胞 （PorcineAlveolar Macrophages，PAM）具有親嗜性，主要感染豬體內的PAM。在感染過程中，PRRSV首先與PAM表面的硫酸乙酰肝素（Heparin Sulphate，HS）接觸，隨后轉換成與唾液酸黏附素（Sialocadhesin，Sn）發生更穩定的互作，形成病毒-受體復合體[14]。復合體在網格蛋白的介導下發生內吞，隨后進入早期包涵體中，在包涵體和PAM表面的CD163（Cluster of Differentiation 163）的作用下，病毒基因組隨之被釋放至細胞質中[14]。PAM被破壞后釋放的超氧化物陰離子使黏膜纖毛系統受損，導致肺泡屏障作用的下降甚至喪失，病原菌侵入肺內導致繼發性感染[15]。

在感染PRRSV早期，PRRSV的GP5蛋白免疫顯性表位誘導機體產生非中和抗體免疫反應，以減弱或屏蔽下游的中和表位，進而導致機體不能產生相應的免疫應答[16]。研究表明，PRRSV逃避及延遲中和抗體過程主要由GP5蛋白的第51位氨基酸和GP3的131位氨基酸N端糖基化介導產生[17]。

PRRSV具有抗體依賴性增強 （Antibody-dependent enhancement，ADE)的生物學特性，ADE的作用使PRRSV更易于侵入靶細胞[18]。有研究顯示，與單獨注射PRRSV相比，豬注射PRRSV和PRRSV抗體后，病毒在胎豬體內的復制顯著增強，而在體外培養的PAM中加入PRRSV抗體后，PRRSV數量也顯著增加[19]。由于PRRSV的ADE作用，當母源抗體水平降至保護水平以下時，通過母原抗體獲得PRRSV被動免疫的仔豬患病風險隨之增加，這也為PRRS防疫帶來困難。此外，PRRSV感染后可引起仔豬淋巴細胞增生，使其發生免疫損傷，并誘導外周血單核細胞和肺泡巨噬細胞等凋亡[20]。PRRSV還可通過誘導調節T細胞分化及T細胞免疫[21]、影響細胞因子的釋放[15]、抑制樹突狀細胞功能[22]等多種途徑抑制機體天然和適應性免疫應答。

2 PRRS的診斷

PRRSV傳染性強，主要經過呼吸道等的水平傳播及胎盤的垂直傳播，對不同生長階段及品種的豬均具有感染力。病豬、帶毒豬、病母豬所產的仔豬均具有傳染性，病豬分泌物、精液、排泄物污染的飼料和水、死胎、胎衣等都可成為傳播媒介，且感染豬臨床癥狀消失后相當一段時間內仍能排毒[23]。與PRRSV相比，HP-PRRSV感染豬發病率更高、發病急、傳播快、病程長，且病死率極高。HP-PRRSV在妊娠母豬和1月齡以內的仔豬最易感，肥育豬也會發病，40日齡以內的仔豬病死率高達100%，育肥豬病死率達50%[24]。

豬感染PRRSV的5d左右即出現明顯臨床癥狀。癥狀包括體持續高熱 （體溫達41℃以上）、精神沉郁、食欲低下，發病早期皮膚發紅，而隨病程發展，病豬出現咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀，四肢、耳部出現藍紫色。妊娠母豬早產、流產、產死胎、木乃伊胎和弱仔，仔豬斷奶前死亡率增加[25]。病豬剖檢可見胸腔積液，全身組織器官均有不同程度的淤血、腫脹，皮下彌漫性出血，肺充血嚴重，肺間質浸潤增寬，肺泡浸潤、出血。鏡檢可見肺組織有明顯出血現象，肺泡面積縮小，血管壁變薄，毛細血管內皮腫脹[26]。

除臨床診斷，逆轉錄PCR（Reverse Transcription-PCR，RT-PCR）、酶聯免疫吸附劑測定 （Enzyme Linked Immunosorbent assay，ELISA）、免疫過氧化物酶細胞單層試驗 （IPMA）、 間接免疫熒光試驗 （Indirect Immunoinfluscent Assay，IFA）、原位雜交 （In Situ Hybridization，ISH）、基因芯片等實驗室診斷技術[27]為準確、快速確診PRRS，防止病情蔓延、減少損傷提供有效方法。其中ELISA由于樣品檢測時間短，且操作過程方便易行，具有高特異性和敏感性，常用于大規模的檢測[28]。RT-PCR技術是近年來快速發展的一種有效的分子生物學診斷技術，檢測快速、準確，在PRRSV感染初期具有高靈敏度，而新建立的多重PCR、RTPCR-RFLP等技術不僅可檢測各種臨床樣品，還可鑒別不同基因型的毒株，區分疫苗株和野毒株[29]，在PRRSV檢測中廣泛應用。

3 PRRS的疫苗防控

3.1 滅活苗與弱毒苗

疫苗免疫是控制PRRS流行經濟比較有效的措施。PRRS疫苗最早于1993年在歐洲開始使用之后北美也開始使用疫苗預防該病。臨床上主要使用滅活苗和弱毒苗來防控PRRS，其中滅活苗生產工藝相對簡單，能有效避免散布病毒和造成新疫源的危險，具有安全、便于貯存及運輸的優點[30]。接種滅活苗的PRRSV感染豬的中和抗體滴度和抗干擾素IFN-γ分泌明顯提高[31]。但滅活苗產生的免疫主要為體液免疫，誘導細胞免疫的能力低，導致免疫效果不理想，不能有效清除感染豬體內的病毒，常導致免疫失敗[32]。此外，滅活苗的還有免疫劑量大、需多次接種等缺點。

通過不同的手段，使PRRSV毒力減弱或消失產生弱毒苗，接種后可刺激機體免疫系統產生針對PRRSV的免疫反應。與滅活苗相比，弱毒苗具有產生抗體快、持續時間長、保護力強等優點，并且在改善臨床癥狀的效果比滅活苗好，但弱毒苗存在散毒和毒力返強的潛在危險[33]。研究表明，從胎兒、死胎及死亡仔豬中分離的疫苗源毒能感染妊娠母豬，接種PRRS弱毒苗導致母豬繁殖性能下降，甚至能通過子宮感染胎豬[34]。

3.2 新型疫苗

隨著分子生物學技術進步，新型PRRSV疫苗得到快速發展，一系列新型疫苗開始出現，并在實驗室階段展示良好的應用前景。基因工程疫苗是新型疫苗的研究重點，包括活載體疫苗、核酸疫苗、重組疫苗等。活病毒載體疫苗是將PRRSV的免疫相關基因整合進另一種載體基因組，動物被接種后，PRRSV免疫原基因可隨載體復制而表達，從而使機體產生免疫應答并獲得對PRRSV的抵抗力。與機體產生特異性抗體有關的GP5通常作為整合基因，如表達PRRSV GP5蛋白的重組牛痘病毒、傳染性胃腸炎病毒、重組偽狂犬病毒的活載體疫苗，此外還有表達GP5和GP3的重組禽痘病毒活載體等[35]。核酸疫苗則通過把外源基因插入真核質粒載體上構成重組質粒，重組質粒注射到動物體內后，外源基因隨著宿主細胞的轉錄合成抗原蛋白，從而激活機體免疫系統[36]。Zhang H B[37]等制備VPIL4/IL6-CNP為一種新型PRRS疫苗，該疫苗融合了豬白細胞介素4（IL-4）和白細胞介素（IL-6），可提高仔豬免疫功能。

除上述幾種疫苗，亞單位疫苗、基因缺失疫苗也是近年來研究較多的新型疫苗。與傳統的疫苗相比，這些新型疫苗可顯著提高機體體液免疫和細胞免疫應答。不過這些疫苗的研制依然還處于實驗室試驗階段，要真正應用于臨床大規模免疫，仍需要很長的時間。

4 結語

PRRSV基因組及抗原性的高度易變異性，以及該病毒所具有的逃避機體免疫監視能力，防疫及完全控制PRRS依然任重道遠。此外，PRRSV還可抑制機體免疫應答，使其他病原的易感性增強，臨床上通常表現為豬繁殖與呼吸綜合征與豬圓環病 （PCV）、豬瘟 （SFV）等疫病的綜合癥狀，這給PRRS的診斷及治療造成極大干擾。PRRSV易變異性等生物學特征給豬群有效免疫帶來挑戰，但疫苗免疫依然是控制PRRS流行的重要途徑，研發確實、高效、可靠的新一代疫苗是控制PRRS的重要途徑。此外，豬場免疫程序中應充分考慮PRRSV疫苗與CSF、口蹄疫 （FMD）、PCV等疫苗之間的干擾現象，避免影響免疫效果。在加強對PRRSV的病毒流行學及病毒作用機制等的研究、加快疫苗研制的同時，必須加強飼養管理、生物安全及環境控制，提升豬群免疫力，發病后采取抗病毒與中藥治療結合的方式，防止繼發感染，及時進行病畜淘汰及尸體無害化處理等措施，防止PSSR的擴散流行。

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