基于HPLC法利用正交實驗法優化提取荷葉中荷葉堿

金元寶+鐘潔丹+李雪玥+林興義+吳玉峰+劉夢嬌+郭樹茂+王立英

摘要：本實驗采用正交實驗法優化荷葉中荷葉堿的提取工藝，利用高效液相色譜法檢測荷葉堿的含量。結果：提取時間60min，提取次數為3次，加水量為10倍量。

關鍵詞：荷葉；荷葉堿；水提取；正交試驗；高效液相法

中圖分類號：G642.423 文獻標志碼：A 文章編號：1674-9324（2018）01-0272-02

荷葉（Nelumbins Folium）系睡蓮科蓮屬植物蓮Nelumbo nucifera Gaertn的干燥葉，含有蓮堿（Roemerine）、原荷葉堿（Pronuciferine）和荷葉堿（Nuciferine）等多種生物堿及維生素C、多糖；具有消暑利濕，健脾升陽，散瘀止血的功效。近代研究證實，荷葉的生物堿成分具有抗菌、抗氧化、降血脂、降膽固醇和減肥等多種生物活性。2003年3月，在中華人民共和國衛生部衛法監發（2002）第51號文件中被列入“既是食品又是藥品”的物品名單中，在食用及藥用兩方面均有較廣泛的應用。

本研究采用水提取法提取荷葉中荷葉堿，并在單因素試驗的基礎上，應用正交試驗法優化荷葉堿的提取工藝，通過對試驗數據進行擬合，研究提取時間、提取次數和加水量對荷葉堿得率的影響以及各考察因素之間的交互作用，旨在為從荷葉中提取荷葉堿提供一種簡便、高效的提取方法。

一、試驗材料與儀器

（一）材料

荷葉飲片，購于廣東珠海萬寶中藥飲片有限公司。

（二）試劑

甲醇（色譜級、西隴化工股份有限公司）、乙腈（色譜級、西隴化工股份有限公司）、冰醋酸（分析純、天津市百世化工有限公司）、三乙胺（分析純、西隴化工股份有限公司）。

（三）儀器

超聲波清洗器（KH-300E、昆山禾創超聲儀器有限公司）、多功能搖擺式粉碎機（浙江溫嶺市銘大藥材機械設備有限公司）、智能恒溫電熱套（鄭州長城科工貿有限公司）、旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）、循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）、電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）、實驗型冷凍干燥機（上海東富龍科技有限公司）、高效液相色譜儀（LC-20A型、日本島津）。

二、方法

（一）色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水-三乙醇胺-冰醋酸（56：44：1：0.15）為流動相；檢測波長為270nm；柱溫為25℃。自動進樣對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測定，即得。其理論塔板數按荷葉堿峰計算應不低于2000。

（二）標準曲線的制備

精密稱取荷葉堿標準品3mg，溶于99%甲醇中，在10ml容量瓶中定容，作為儲備液I（0.3mg/ml）。取儲備液I4ml于50ml容量瓶中用99%甲醇定容，作為儲備液II（24μg/ml）。從儲備液II中各取2、3、4、7、8ml，分別置于10ml容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列標準品儲備液，其濃度分別為4.8、7.2、9.6、16.8、19.2ug/ml。以標準品濃度（μg/ml）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線得到回歸方程y=57413x+4431.4，R2=0.9998，線性范圍為4.8-19.2μg/ml。

（三）藥材吸水率試驗

稱取50g荷葉飲片于2500ml燒杯中壓實，加入500ml水，浸泡30min，可見白心；再分次加入50ml水，每次浸泡30min，至不見白心。得浸泡時間約為120min。吸水量結果如表1，可知荷葉吸水量約為4倍量。

（四）單因素實驗

1.提取時間對荷葉堿提率的影響。在加水量為10倍，煎煮次數一次的條件下，做提取時間的單因素試驗，提取時間選擇20min，30min，40min，60min，80min，確定提取時間。

2.加水量對荷葉堿提取率的影響。在提取時間為1h，煎煮次數一次的條件下，做加水量的單因素試驗，加水量選擇8、10、12、14、16倍，確定加水量。

3.提取次數對荷葉堿提取率的影響。在提取時間為1h，加水量為10倍條件下，做提取次數的單因素試驗，提取次數選擇1次、2次、3次、4次和5次。確定提取次數。

4.正交實驗優化。在單因素的基礎上，設計正交試驗，因素主要有A：提取時間；B：提取次數；C：加水量三個因素，每個因素擬考察3個水平，見表2。

由以上因素水平，確定按照L9（3）4正交表進行試驗，稱取荷葉9份，每份50g，按照表3條件進行試驗，統一安排第一次加水量追加4倍，并在首次加熱提取之前先浸泡2h。以荷葉堿提取率做考察指標。

三、結果與討論

（一）單因素試驗優化荷葉堿提取條件

提取時間：當提取時間為40min時，荷葉提取率最高。

加水量：當加水量為10倍時，荷葉提取率最高。

提取次數：當提取次數2次時，荷葉堿提取率最高。

（二）正交試驗優化結果

表4方差分析結果可知，各因素對試驗結果影響的重要性依次為B>A>C，即提取時間A、提取次數B是主要影響因素，而加水量C是次要影響因素。表5直觀分析結果顯示，各因素的最佳水平依次為：A因素的第3水平，B因素的第3水平，C因素的第2水平，即A3B3C2。即加水提取3次，第一次加水14倍量（其中4倍量是藥材的吸水量），浸泡2h，提取1h，趁熱濾過；第二次加水10倍量，提取1h，趁熱濾過；第三次加水10倍量，提取1h，趁熱濾過，合并濾液。

（三）提取工藝驗證性試驗

為了驗證正交試驗優選出的最佳工藝條件的準確性和重現性，故進行驗證性試驗。取荷葉飲片50g，共3份，按確定的最佳提取工藝條件進行提取，減壓濃縮，考察荷葉堿提取率。三批樣品的出膏率和總含量的RSD分別為0.065%和0.033%，重現性良好，故確定A3B3C2為最佳提取工藝。

四、結論與展望

本實驗采用正交實驗法優化荷葉中荷葉堿的提取工藝。結果：提取時間60min，提取次數3次，加水量為10倍量。

荷葉中荷葉堿含量較高，荷葉堿又是主要的降脂成分，所以選用荷葉堿作為荷葉配方顆粒的指標成分。

參考文獻：

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[3]范婷婷.荷葉生物堿類物質降脂減肥活性研究[D].杭州：浙江大學，2013.

Abstract：In this experiment，the extraction process of nuciferine in lotus leaf by orthogonal experimental method. Determination of the content of lotus leaf by high performance liquid chromatography. Results：the extraction time was 60min，the extraction time was 3 times，and the amount of water was about 10 times.

Key words：nelumbins folium；lotus root；water extraction；orthogonal test；hplcendprint