CMV-IB侵染誘導煙草內質網應激

董文鳳，李方方，何青云，肖志新，孫航軍，王升平，楊金廣，王鳳龍，申莉莉*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.云南省煙草公司保山市公司，云南 保山 678000）

內質網（ER）是真核生物細胞中蛋白合成修飾的場所。動物病毒蛋白蓄積使ER腔內穩態失衡，產生內質網應激（ER stress）。細胞首先啟動未折疊蛋白應答（UPR），信號因子BiP與ER膜上的前體蛋白[蛋白激酶類內質網激酶（PERK）、需肌醇酶（IRE1）和轉錄激活因子（ATF6）]解偶聯，分別開啟蛋白合成控制、蛋白降解和蛋白折疊3條UPR通路恢復內穩態[1-3]。若ER stress持續過長，細胞則轉向程序性死亡（PCD），激活凋亡基因，以凋亡或自噬的方式抵御病毒。植物在ER stress誘導劑衣霉素處理下或遭受高溫、干旱、鹽害、病毒和細菌侵入時產生ER stress[4-5]。擬南芥中已發現高溫或衣霉素誘導的兩條UPR信號bZIP28和bZIP60，及一條PCD信號NAC089[6-9]，尚未發現PERK路徑。水稻OsbZIP50、玉米ZmbZIP60、煙草NtbZIP60均參與UPR，調控寄主的抗性反應[10-12]。

采用熒光蛋白標記單鏈RNA病毒和ER的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到病毒蛋白誘導ER膜形成病毒的復制結構。TMV-GFP侵染本氏煙早期，運動蛋白（MP）和復制酶（RdRp）停泊于ER上聚集成小點狀結構，隨后ER微管轉變成大的聚集體，是病毒復制場所。侵染后期，聚集體又轉變成微管，此變化與MP的積累和降解同步[13]。馬鈴薯Y病毒（PVY）的6K2蛋白誘導ER形成包含6K2在內的病毒復制囊泡[14]。水稻黑條矮縮病毒（RBSDV）的P10蛋白定位于ER膜上，誘導ER形成多孔結構[15]。雀麥花葉病毒（BMV）RNA1編碼的復制酶1a蛋白可單獨結合在ER外膜上，誘導ER外膜內陷形成內質網小球[16]。此外煙草飾紋病毒（TEV）和馬鈴薯X病毒（PVX）均在ER內陷的膜結構上復制，但其誘導膜形成的機制尚不清楚[17]。

植物病毒侵染還誘導ER stress相關的UPR信號bZIP60[18]，如PVX侵染本氏煙3 d，UPR基因（BiP、bZIP60和SKP1）轉錄水平提高3倍，過表達BiP緩解ER stress相關的PCD癥狀。TMV-TGBp3接種本氏煙，UPR基因在8 h內上調15～35倍，在出現PCD前下降；過表達BiP抑制PCD，顯示UPR是居前的生存機制[19]。RBSDV侵染本氏煙和水稻原生質體2 d，其P10觸發BiP、bZIP60、PDI、CAM表達上調2.5～3.5倍[15]。GarVX侵染本氏煙3 d，bZIP60和BiP表達上調9.5～10.6倍[20]。

此外，在TMV侵染含N基因的轉基因煙草產生的枯斑及其臨近健康細胞的胞質和液泡中，觀察到包裹胞質和細胞器的雙層膜自噬泡，及自噬小體與液泡逐漸融合的過程，說明N基因介導的抗TMV的過敏性壞死反應（HR）誘發了細胞自噬[21]。TMV侵染海拉細胞時，TMV-RNA在ER膜上被翻譯成MP，+RNA從細胞質轉移到細胞核，同時BiP表達上調；病毒蛋白在自噬小泡膜上積累，形成的自噬小泡與ER膜擴大密切相關。顯示海拉細胞用ER stress及自噬來抵御TMV[22]。利用透射電鏡和自噬基因ATG8-GFP瞬時表達技術，證明TMV侵染誘導煙草細胞自噬[23]。

為明確利用液泡膜復制的三分體RNA病毒CMV是否誘導寄主ER stress，本文在CMV-IB侵染三生煙和本氏煙體系中，進行了qRT-PCR檢測ER stress相關基因的轉錄激活，農桿菌介導的ER marker（ER-mCherry）瞬時轉染后激光共聚焦觀察ER形態，以及電鏡觀察細胞自噬結構的研究。

1 材料與方法

1.1 供試煙草、病毒和載體

三生煙（N.tabacumcv.Samsun NN）、本氏煙（N.benthamiana）；CMV-IB株系；Fu46-RFP入門載體、pEarlyGate100表達載體、pEasy?-T1克隆載體。

1.2 試驗設計

CMV提純采用PEG法[24]。試驗設2個處理，即4葉期植株分別摩擦接種CMV或磷酸緩沖液（PBS）對照。每處理48株，25℃/16 h光照培養。

接種后0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h、6 d、9 d，每時間點每處理選取4株，每株取相同葉位接種葉1片，于液氮中迅速冷凍，?70℃保存，備RNA提取和qRT-PCR檢測。

接種后0 h、24 h、72 h、6 d，各處理分別取無擦傷接種葉1片，用手術刀切下 2 mm×1 mm的小塊（避開葉脈正方形四點取樣），放入1.5 mL離心管中，加2.5%戊二醛固定，抽真空后4℃冰箱貯藏，備電鏡樣品制備。

接種后3 d、5 d、8 d、12 d，每處理選擇3株，在接種葉和新葉上浸潤注射ER-marker（mCherry-HDEL），48 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察ER形態。

1.3 CMV CP及ER stress相關基因檢測

1.3.1 引物設計 根據CMV-IB株系的CP序列和中國煙草基因組數據庫（http://218.28.140.17/）中各基因的CDS，采用Primer5.0軟件設計熒光定量引物（表1）。

1.3.2 qRT-PCR檢測 Trizol法提取葉片總RNA后，于Thermo微量核酸紫外分析儀上檢測RNA濃度和純度。一步法合成第一鏈cDNA且去除gDNA。采用SYBR在ABI7500上進行qRT-PCR反應。用相對CT法公式2-??CT，以Actin為內參，以0 h樣品的CT值為標準1，計算各取樣點的相對RNA積累量[19,25]。

1.4 電鏡樣品制備及觀察

樣品經固定、脫水、包埋、烘干、切片和染色后，在JEM-1200EX型透射電鏡下觀察[26]。拍照記錄病毒粒體分布及葉綠體、線粒體、液泡等細胞器形態。

1.5 ER marker標記及形態觀察

1.5.1 引物設計 根據Fu46-RFP入門載體上RFP序列合成帶有寡聚核苷酸序列的引物對ER signal F/R和帶有HDEL序列的引物對RFP F/R（表2）。

1.5.2 ER-marker（mCherry-HDEL）質粒構建 人工合成兩條含有ER信號肽序列的oligo DNA（ER signal F/R），退火形成雙鏈DNA后與用HindIII和EcoR?雙酶切的載體（Fu46-RFP）連接構成重組質粒（pSP-Fu46-RFP），并轉化至大腸桿菌中，檢測陽性克隆。以RFP F/R引物對（反向引物帶有HDEL，表2）從pSP-Fu46-RFP中擴增RFP，回收產物并與用EcoR?和Sac?雙酶切的SP-Fu46-RFP連接構成重組質粒SP-Fu46-RFP-HDEL，轉化至大腸桿菌中，檢測陽性克隆。利用LR反應將目的基因重組至表達載體pEarleyGate 100中，構成ER marker（mCherry-HDEL）[26]。

1.5.3 農桿菌浸潤瞬時轉染和激光共聚焦顯微觀察 將重組質粒轉化至LBA4404農桿菌感受態細胞中，28℃過夜培養。離心收集菌體，用緩沖液（含10 mmol/L MgCl2，pH=5.5 10 mmol/L MES，200 μmol/LAS）懸浮，調節至OD600nm=0.6，25 ℃孵育4 h。用針頭在葉背刺一微傷口，將懸液加入去針頭的注射器，拇指頂住葉片，從傷口處注射入葉片。26℃培養48 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號。RFP的激發波長為552 nm，接收波長為570～620 nm[15,26]。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 List of quantitative RT-PCR primers of N.tabacum and N.benthamiana

表2 內質網ER Marker（mCherry-HDEL）引物Table 2 List of primers used to ER-RFP

2 結果

2.1 CMV-IB系統侵染三生煙和本氏煙

提純的CMV-IB（50 μg/mL）摩擦接種三生煙，第5天接種葉表現脈明，隨后出現花葉和綠島癥狀。第10天新葉表現脈明和花葉癥狀，第14天新葉呈現黃綠相間的花葉狹長癥狀，第18天接種葉表現橡葉紋狀壞死。CMV-IB在本氏煙上也表現系統感染癥狀，心葉呈現皺縮、扭曲和畸形癥狀，植株矮化（圖1）。

圖1 CMV-IB在三生煙（A）和本氏煙（B）上的癥狀Fig.1 Symptoms of CMV-?B on N.tabacum cv.Samsun NN(A)and N.benthamiana（B）

在Thermol微量核酸紫外分析儀上檢測提取的RNA，顯示樣品純度為A260/280比值為 1.99～2.08，A260/230比值為1.46～1.93，樣品的純度和濃度符合qRT-PCR的要求。配制qRT-PCR反應體系，檢測CMV CP轉錄水平，結果顯示，三生煙和本氏煙在接種CMV后第3天檢測到外殼蛋白RNA，隨后逐漸升高，第6天達到峰值，然后進入平臺期（圖2）。

2.2 CMV-IB侵染激活寄主ER stress相關基因的表達

采用qRT-PCR檢測7個ER stress相關基因（BiP、CAM、PDI、SKP1、bZIP60、bZIP28、NAC089）的轉錄水平。三生煙上的結果顯示，與0 h（未接種）相比，接種CMV的處理UPR基因在6～12 h表達量顯著提高，其中BiP、CAM、PDI和SKP1在12 h的相對表達量RQ值分別達到35.36、62.65、15.60和10.55；PCD基因NAC089在48～72 h表達量顯著提高。PBS對照處理的ER stress相關基因變化較小。與PBS對照相比，UPR基因的表達在接種CMV后6 h提高了2.64～5.18倍，接種后12 h提高了2.30～7.37倍；PCD基因NAC089則在48 h和72 h表達量分別提高了1.96倍和2.09倍（圖3）。

在本氏煙上檢測到相同趨勢的試驗結果。即：與PBS對照相比，UPR基因在接種CMV后12 h顯著上調1.25～4.21倍，PCD基因NAC089在48 h提高2.15倍，與壞死相關的基因SKP1在72 h提高1.88倍（圖4）。上述試驗結果表明，CMV侵染激活了ER stress相關的轉錄信號，且UPR是居前的信號。

圖2 CMV CP在三生煙(A)和本氏煙(B)接種葉內的積累Fig.2 CMV CP expression in inoculated leaves conducted by qRT-PCR

圖3 三生煙接種CMV較PBS對照ER stress基因的表達差異Fig.3 Upregulation of ER stress genes in CMV infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

圖4 本氏煙接種CMV較PBS對照ERstress基因的表達差異Fig.4 Upregulation of ER stress genes in CMV infected N.benthamiana leaves

2.3 CMV-IB侵染煙草的細胞病變

2.3.1 CMV-IB侵染導致細胞器降解 采用電子顯微鏡觀察CMV侵染的三生煙細胞，結果顯示，相對于正常細胞，病變細胞的液泡增多，細胞質中布滿CMV粒子，胞間連絲呈擴張狀，附近分散有病毒粒子（圖5A）。病變細胞的線粒體腫脹，膜完整性被破壞（圖5B）。病變嚴重的細胞出現葉綠體降解，內中的淀粉粒和脊上的片層結構畸形（圖5C）。過氧化物酶體周圍布滿病毒粒子，但在對照和CMV侵染的細胞中均出現過氧化物酶體的晶格排列（圖6A）。正常細胞其細胞核位于細胞質中，核膜完整，而CMV侵染的細胞其細胞核游離于細胞質，核膜開始破裂（圖6B）。在液泡膜邊緣出現小的囊泡狀結構，伴隨分布大量的病毒粒子。中空細胞的液泡中出現絲狀鏈接的降解結構，甚至空泡化，即細胞質缺失，細胞器降解（圖6C）。

CMV侵染本氏煙亦導致線粒體和葉綠體膜完整性損壞，周圍布滿病毒粒子（圖7）。上述結果顯示CMV侵染煙草導致顯著的細胞病理性病變，病毒粒子逐漸遍布于細胞質、液泡周圍及胞間連絲處；各亞細胞器的完整膜結構喪失、內部結構逐漸降解；侵染后期隨病毒粒子的增多，細胞器完全降解，病變嚴重的細胞出現空泡化凋亡。

2.3.2 CMV-IB侵染誘發自噬結構 電鏡下觀察CMV侵染三生煙前期（24～72 h）和后期（6～9 d）的葉片細胞，結果顯示，在侵染早期，細胞中未觀察到病毒粒子，沿液泡膜出現不同時期的內陷的膜狀結構，直徑約300 nm，內中包裹著大小不等的雙層膜的囊泡（圖8A）。在侵染后期，細胞中布滿病毒粒子，細胞質中出現較大的雙層膜狀結構，直徑約1～3 μm，內中有典型的水解性液泡（pre lytic vacuole，pre-LV）、坍塌的液泡膜（collapsed vacuole membrane，cVM）和中心自噬泡（autophagic vacuole，AV）。大量的病毒粒子聚集在此種結構周圍（圖8B）。在CMV侵染本氏煙的葉片細胞中也觀察到上述兩種囊泡結構（圖9）。

圖5 CMV侵染三生煙的病毒分布（A）、線粒體病變（B）和葉綠體降解（C）Fig.5 The virus distribution(A),mitochondria swelling(B),and chloroplasts degraded(C)in CMV infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

圖6 CMV侵染三生煙的過氧化物酶體病變（A）、細胞核游離（B）及病毒性小囊泡和降解泡（C）Fig.6 The peroxisomes lesion(A),nucleus dissociated(B),virus associated vesicae and degraded structures(C)in CMV infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

圖7 CMV侵染本氏煙的病毒分布（A）、葉綠體和線粒體病變（B）Fig.7 The virus distribution(A),mitochondria swelling,and chloroplasts degraded(B)in CMV infected N.benthamiana leaves

圖8 CMV侵染三生煙誘發微自噬和巨自噬結構Fig.8 The microautophagy and macroautophagic structures in CMV infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

圖9 CMV侵染本氏煙誘發微自噬和巨自噬結構Fig.9 The microautophagy and macroautophagic structures in CMV infected N.benthamiana leaves

根據Van Doom和Papini（2013）有關植物體中自噬結構的描述，上述兩種復合囊泡狀結構分別為發生在液泡膜邊緣的微自噬和發生在細胞質中的巨自噬[27]，文中還描述了過氧化物酶體、線粒體等細胞器自噬。本文發現在CMV侵染的細胞中，自噬結構顯著增加，在侵染后期的一些細胞中，細胞器降解和細胞空泡化凋亡普遍。

2.4 CMV-IB侵染煙草誘發ER形態變化

采用農桿菌介導的瞬時轉染在預先接種CMV的葉片細胞中表達ERmarker（mCherry-HDEL）48 h，激光共聚焦顯微鏡下觀察發現：PBS對照處理中，RFP的表達呈現典型清晰的ER網狀結構。而接種CMV后5 d，ER網狀微絲出現增生，形成沿微絲的逐漸增大的囊泡狀。第10天呈現紅色小囊泡狀結構，類似于包被蛋白復合囊泡（coat protein complex П vesicles，COPП）。侵染后期（15 d）增生聚集的囊泡又逐漸恢復成ER的網狀微絲結構，但部分區域仍清晰可見小囊泡狀結構（圖10）。

本氏煙在接種CMV后5～7 d，ER的網狀微絲逐漸增厚，形成囊泡；到第10天增生現象更為顯著，第15天逐漸恢復成網狀微絲結構。在接種葉上部表現花葉癥狀的新葉中，既觀察到ER增生現象又有ER的典型網狀結構（圖11）。ER的這種形態變化說明在CMV初侵染和系統侵染的細胞中，ER的網狀微絲經歷了膜重排和膜恢復的過程。

3 討論

3.1 CMV-IB系統侵染煙草

CMV根據血清學和基因組序列差異可分為?亞組和II亞組，II亞組流行于熱帶和亞熱帶，癥狀較重；?亞組主要流行于溫帶，其中?A株系導致豇豆（Vigna unguiculata）系統花葉癥狀，而?B株系則產生局部壞死癥狀[28]。?B株系侵染煙草，產生較重的花葉和畸形癥狀，干旱條件下出現橡葉紋狀壞死[29]。本文顯示CMV-?B系統侵染三生煙和本氏煙，表現花葉、畸形和橡葉紋癥狀；接種后3 d可檢測到子代病毒，第6天達到增殖高峰。之前報道CMV-Y株系在22～28℃接種珊西煙（N.tabacumcv.Xanthi nc）后1 d能檢測到子代病毒，第3天達到復制高峰[30]。應是病毒株系、培養溫度和寄主生育期的不同，造成CMV積累量的不同，表現為不同的初始檢出點和高峰點。

圖10 CMV誘導三生煙ER膜增生和重排Fig.10 The membrane rearrangements of ER noted by circle in epidemis cells of CMV-infected N.tabacum cv.Samsun NN leaves

圖11 CMV誘導本氏煙ER膜增生和重排Fig.11 The membrane rearrangements of ER noted by circle in epidemis cells of CMV-infected N.benthamiana leaves

3.2 病毒激活寄主ER stress相關基因

研究表明，RBSTV P10，PVX TGBp3和GarVX p11侵染本氏煙后2 d，誘導ER stress伴侶蛋白BiP和UPR信號因子NbbZIP60等轉錄水平上調約3倍[15,19-20]。重組病毒TMV-TGBp3或TMV-p11侵染本氏煙，不僅誘導UPR基因顯著上調，且產生UPR相關的PCD癥狀[19-20]。

本文顯示UPR基因（BiP，CAM，PDI，bZIP28和bZIP60）在接種CMV后6～12 h被顯著誘導上調，PCD基因NAC089則在48～72 h顯著被誘導，表明CMV侵染激活了ER stress相關的信號，且UPR是居前的信號通路。

3.3 病毒誘發寄主ER膜重排和增生

ER參與很多RNA病毒的復制、轉運和組裝，如TMV、BMV和PVY誘導ER膜形態發生巨大改變，形成復制的布袋結構或球形凹陷結構[13,16,19]。最近研究表明RBSTV P10，PVX TGBp3和GarVX p11侵染本氏煙，也誘導ER膜結構重排和增生[15,19-20]。

本文通過構建ER marker（mCherry-HDEL）經農桿菌介導瞬時轉染，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到CMV侵染后，ER膜明顯增生，在侵染早期逐漸形成囊泡狀的點狀結構，侵染后期又恢復成清晰的網狀微絲結構。在表現花葉的新葉中，ER的清晰微絲與增生囊泡共存。這說明，雖然CMV不在ER膜上復制，但ER參與病毒的復制，經歷了巨大的形態改變。此外，形成的這些囊泡狀結構類似于包被蛋白復合囊泡COPII。研究表明COPII參與TMV的胞內轉運；且在ER膜蛋白AtbZIP28從ER到Golgi的輸出中發揮重要作用[31]。

3.4 CMV侵染煙草導致細胞器降解和自噬結構增多

在CMV侵染的病變細胞中，觀察到葉綠體畸形，片層結構解離；線粒體腫脹，膜結構被破壞；液泡增多。這些細胞器的病變與之前報道的CMV侵染煙草的細胞病理相似[32]。過氧化物酶體中有序排列的晶體結構、葉綠體中類囊體膜結構對稱性的喪失，在CMV（Y-GM2）侵染心葉煙（N.Glutinosa）中也報道過[27]。

重要的是，在侵染前期的細胞中，沿液泡膜內陷形成內中包裹小的雙層膜結構的復合囊泡；侵染后期在布滿病毒粒子的細胞質中，還出現另一種包裹中心自噬泡的復合囊泡。根據TMV侵染含N基因的轉基因煙草誘導寄主細胞自噬和植物細胞中自噬結構的描述[21,23]，顯示我們觀測到了CMV侵染煙草誘發的寄主細胞微自噬和巨自噬。

上述細胞器降解初期和巨自噬結構均伴隨著大量病毒粒子，而病變嚴重的空泡細胞中未觀察到病毒粒子，暗示CMV侵染煙草造成的細胞器降解和自噬結構增多與寄主的基礎抗性反應密切相關。

此外，沿液泡膜外緣不僅分布大量病毒粒子，且出現一些小的囊泡狀結構，這可能是病毒的復制結構。洪健等[32]在CMV侵染心葉煙的細胞中，也觀察到此種沿液泡膜分布的伴隨病毒粒子出現的病毒性小泡。CILLO等[33]通過免疫膠體金電鏡，觀察到病毒的復制酶蛋白1a和2a主要分布在液泡膜周圍，顯示CMV利用液泡膜進行病毒增殖。

CMV在液泡膜上復制后，是如何轉運到胞間連絲處？ER膜上增生的類似COPП的囊泡狀結構，是CMV胞內轉運的載體，還是參與ER腔蛋白NbbZIP28的輸出[31]，尚需通過CMV的侵染性克隆及其與液泡和內質網的互作，以及NbbZIP28蛋白從ER到Golgi的轉運過程加以確認。

4 結論

本文研究表明，CMV-?B系統侵染三生煙和本氏煙，表現?B株系的典型花葉和畸形癥狀。CMV侵染通過激活ER stress相關基因和誘導ER膜結構增生、重排而引起寄主細胞內質網應激。寄主細胞會以微自噬、巨自噬及細胞器降解的方式抵御病毒侵染，嚴重者表現為細胞空泡化凋亡，導致寄主葉片組織壞死。

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