曬黃煙調制期煙葉真菌多樣性研究

米其利，錢穎穎，朱洲海，管 瑩，高 茜，陳建華，謝麗華，李雪梅，霍世東，方 耀，夭建華*，文孟良

（1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，昆明 650106；2.云南大學，云南省微生物研究所，昆明 650091；3.云南農業大學煙草學院，昆明 650201）

成熟的煙葉采收后，大量的微生物，包括細菌、真菌、酵母和放線菌等，仍然存在于煙葉的表面或組織內。在煙葉的調制過程中，這些微生物通過分解煙葉中的糖類和蛋白質等物質來獲取自身生長所需的營養和能量，并將這些大分子物質分解為酚類、醇類、酯類等小分子物質，微生物的代謝活動對煙葉化學成分的組成和煙葉品質的形成都會產生重要的影響[1]。煙葉細菌的多樣性及其對煙葉品質形成的影響研究報道較多[2-7]。真菌是煙葉微生物的另一大類群，數量僅次于細菌[6]。與細菌相比，目前對煙草真菌種群和結構的研究比較少，主要是采用純培養方法對一些烤煙煙草內生真菌進行了分離鑒定[8-11]。煙草真菌具有有利和有害兩個方面的作用，如防治煙草病蟲害[8]、降低煙堿含量[12-14]、改善煙葉品質[15-17]、引起煙草病害[18]和煙葉腐爛變質等[19-21]。

曬黃煙是我國特有的一種煙葉類型，幾百年的栽培和種植使之形成了獨特的煙葉品質，是我國發展具有獨特香氣風格和口味特征的中式卷煙的優質原料。本文采用純培養分離和ITS序列系統發育分析方法，研究曬黃煙煙葉晾曬調制期真菌群落結構的組成和動態變化，為人工調控并改進曬黃煙煙葉調制方式，提升煙葉品質提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品取自曬黃煙云曬1號調制過程中的煙葉，該品種種植于云南盈江弄璋曬黃煙基地。

1.2 方法

1.2.1 煙葉調制和取樣 云曬1號煙葉的調制和取樣方法參照倪紅梅等[7]的方法，2013年3月至4月期間，依次收集下、中和上3個部位的新鮮煙葉（調制第1天）、調制中期煙葉（調制第7天）和調制結束煙葉（調制第13天）。

1.2.2 真菌的分離和純化 煙葉菌懸液的制備參照雷麗萍等[22]方法，略有改進。分別稱取5 g煙葉，剪碎后放入含95 mL無菌磷酸緩沖液（pH 7.0～7.2）的無菌料理杯內，攪碎處理1 min。倒入無菌三角瓶內，置于搖床室溫140 r/m振蕩30 min，再置于超聲波清洗機中超聲5 min。收集濾液，梯度稀釋后采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）和沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）于28℃培養分離真菌。通過菌落的培養特征，包括菌落形狀、菌落顏色、菌落表面狀態、隆起狀態、邊緣情況和孢子顏色等，以及菌絲、孢子和產孢結構的形態特征進行初步歸類，將菌株歸類到各自的形態型，進行后續的分析。

1.2.3 菌株DNA提取及ITS序列分析 從每個形態型真菌中選1株作為代表，采用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取菌株的總DNA。選取真菌ITS基因擴增和測序，引物序列：ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'， ITS4 ：5'-TC CTCCGCTTATTGATATGC-3'[23]。將獲得的ITS序列進行校正后，使用NCBI GenBank（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行同源性搜索。利用ClustalX軟件對獲得的ITS序列與近緣種的ITS序列進行多重序列比對，然后通過MEGA 6.0軟件，以Kimura2-parameter模型計算進化距離，基于Neighbor-Joining法構建系統發育樹[24]。

1.2.4 物種多樣性分析 調制期曬黃煙煙葉中純培養真菌的多樣性評估，采用Shannon多樣性指數（H’），Simpson多樣性指數（D）和Shannon均勻度指數（EH），計算公式如下：

其中，Ni為樣品中第i個分類單元的菌株數目，N為所有菌株數總和。

2 結果

2.1 真菌菌株分離結果

采用PDA培養基和SDA培養基雙平板法，從云曬1號調制期煙葉中分離真菌，兩種培養基上的菌落數都比較多，菌落多樣性比較豐富，兩種培養基對煙葉真菌的分離效果沒有明顯差異。根據菌落形態特征挑取單菌落，共分離獲得126株真菌，其中，57株分離自PDA培養基，69株分離自SDA培養基。自下部煙葉分離得到50株，中部煙葉得到35株，上部煙葉得到41株；調制中期分離到32株，少于調制前期的51株和調制結束的43株（表1）。

表1 各調制期煙葉樣本真菌菌株分離數量Table 1 The fungal isolate amount of curing leaves

2.2 真菌多樣性分析

根據菌株在PDA和SDA培養基上的培養特征將獲得的126株真菌初步歸類，選擇代表性菌株進行ITS基因序列測序。將測定的73株真菌序列分別在GenBank數據庫中Blast同源性搜索，獲得近緣種的序列，同源性搜索結果顯示有38株不同的代表性菌株（表2）。從表2看出，Shannon多樣性指數（H'）、Simpson多樣性指數（D）和Shannon均勻度指數（EH）分別為3.42、0.96和0.71，表明云曬1號調制期煙葉樣本中純培養真菌的類群多樣性比較豐富。

38株代表性真菌菌株中，有35株分別與相關已知真菌菌株的ITS基因序列相似性為100%，另有3株相似性為99%。有11株菌株（YT200045、YT200034、YT200023、YT200123、YT200049、YT200021、YT200092、YT200053、YT200084、YT200003、YT200121）和屬級分類水平上未知物種的ITS基因序列相似性是100%，有3株菌株YT200010、YT200101和YT200124與屬級分類水平上未知物種的ITS基因序列相似性為99%（表2），推測該14株菌可能是分類地位未確定的物種。

表2 曬黃煙調制期煙葉樣本中純培養真菌的分離和近緣種分析Table 2 The fungal isolation and analysis of yellow sun-cured tobacco curing leaves with closest species

由表3看出，在126株真菌中，絕大多數菌株（118株）屬于子囊菌門（Ascomycota），占總數的93.65%。子囊菌門的菌株在綱、目、科和屬等分類水平上的多樣性較為豐富，包括4綱、9目、13科、16屬。僅有8株菌株屬于接合菌門（Zygomycota），占6.35%，僅1個屬。在綱分類水平上，座囊菌綱（Dothideomycetes），有53株，占42.06%；糞殼菌綱（Sordariomycetes），有51株，占40.48%；散囊菌綱（Eurotiomycetes），有12株，占9.52%；盤菌綱（Pezizomycetes），有2株，占1.59%；接合菌綱（Zygomycetes），有8株，占6.35%。在目分類水平上，格孢腔菌目（Pleosporales）為優勢目，有51株，占40.48%；其次是肉座菌目（Hypocreales）、炭角菌目（Xylariales）和散囊菌目（Eurotiales），分別有22、17和12株；屬于假毛球殼目（Trichosphaeriales）、盤菌目（Pezizales）、糞殼菌目（Sordariales）、小叢殼目（Glomerellales）和縱裂菌目（Hysteriales）等目的菌株相對較少。在科分類水平上，亞隔孢殼科（Didymellaceae），有39株，占30.95%；梨孢假殼科（Apiosporaceae），有17株，占13.49%；叢赤殼科（Nectriaceae），有15株，占11.90%；曲霉科（Aspergillaceae）和格孢腔菌科（Pleosporaceae），各有10株，分別占7.94%；假毛殼球科（Trichosphaeriaceae），有9株，占7.14%；肉座菌科（Hypocreaceae），有7株，占5.56%；發菌科（Trichocomaceae）、火絲菌科（Pyronemataceae）、小不整球殼科（Plectosphaerellaceae）、縱裂菌科（Hysteriaceae）和莢孢腔菌科（Sporormiaceae）各有2株，分別占1.59%；毛殼菌科（Chaetomiaceae），有1株，占0.79%。

在屬的分類水平上，126株真菌的分布如圖1，附球菌屬（Epicoccum）、節菱孢屬（Arthrinium）和鐮孢菌屬（Fusarium）分離菌株數量相對較多，是曬黃煙煙葉真菌的優勢類群，分別有29株、17株、15株，占分離菌株總數分別為23.02%、13.49%和11.90%；其次是鏈格孢屬（Alternaria）和黑孢菌屬（Nigrospora），分別有10株和9株；毛霉屬（Mucor）和莖點霉屬（Phoma），各有 8株；木霉屬（Trichoderma）和青霉屬（Penicillium），各有7株；曲霉屬（Aspergillus），有 3株；踝節菌屬（Talaromyces）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）、無墊船殼菌屬（Psiloglonium）、亞隔孢殼屬（Didymella）、分孢梗殼菌屬（Pycnidiophora）和火絲菌屬（Pyronema），各有2株；毛殼屬（Chaetomium），有1株。

表3 曬黃煙煙葉中純培養真菌的菌群結構Table 3 Composition of cultured fungi isolated from yellow sun-cured tobacco leaves

圖1 126株真菌分離菌株在屬級分類水平的分布Fig.1 The distribution of 126 fungal strains from yellow sun-cured curing tobacco leaves in genus

利用ClustalX 1.8軟件進行菌株ITS序列的多重比對后，用Mega 6.0構建系統發育樹，進行1000次Bootstrap統計學檢驗（圖2）。系統發育分析結果顯示，曬黃煙調制期煙葉純培養真菌聚類為2個大分支：A分支和B分支。A分支為子囊菌門，包括Ⅰ亞分支、Ⅱ亞分支、Ⅲ亞分支和Ⅳ亞分支，依次為糞殼菌綱、散囊菌綱、盤菌綱和座囊菌綱。B分支為接合菌門，由Ⅴ亞分支接合菌綱組成。

3 討論

本文選用PDA和SDA兩種培養基對調制期云南曬黃煙煙葉的純培養真菌進行了分離，共獲得126株菌株。根據菌株的形態特征和ITS序列系統發育分析，126株真菌分布在2門、5綱、10目、14科和17屬，這17個屬分別為附球菌屬、節菱孢屬、鐮孢菌屬、鏈格孢屬、黑孢菌屬、毛霉屬、木霉屬、青霉屬、莖點霉屬、曲霉屬、踝節菌屬、小不整球殼屬、無墊船殼菌屬、亞隔孢殼屬、分孢梗殼菌屬、火絲菌屬和毛殼屬，有14株菌可能是未確定分類地位的物種。

曬黃煙在調制期煙葉的優勢真菌類群為附球菌屬、節菱孢屬和鐮孢菌屬，分別占分離菌株總數的23.02%、13.49%和11.90%。附球菌屬菌株在衰老或剛死亡的植株表面能迅速產生分生孢子和抗真菌化合物[25]，因此可以作為一種生防菌應用于植物病害的生物防治中，例如可以降低核盤菌對萵苣的侵染[26]，抑制小麥禾旋孢腔菌的生長[27]，抑制桃樹的桃褐腐病的發生[28]，拮抗樟子松枯梢病病原菌的生長[29]等。而鐮孢菌屬菌株可引起多種煙草病害，如煙草枯萎病和鐮刀菌根腐病[30]。對烤煙的內生真菌的研究表明，鏈格孢屬和鐮孢菌屬是主要的真菌類群[8-11]。鏈格孢屬是分布廣泛的重要的半知菌類真菌，能夠引起多種植物病害及腐霉病，造成全球性的巨大經濟損失[31]。

在煙草中，鏈格孢屬菌株也是引起煙草病害的一類重要的致病微生物[32]。本文從曬黃煙煙葉中共分離到10株鏈格孢屬菌株，占分離菌株總數的7.94%。另一方面，在煙葉的加工和存儲過程中，某些霉菌的生長和繁殖，會造成煙葉的大量霉變，而曲霉、青霉和毛霉屬真菌是引起我國煙葉霉變的主要菌類[33]。從曬黃煙調制期煙葉中共分離到3株曲霉、7株青霉和8株毛霉屬菌株，在調制后的煙葉醇化或存儲中，如遇煙葉受潮以及適宜的環境溫度和濕度，這些霉菌有可能引起煙葉的霉變。

圖2 基于ITS序列構建純培養真菌的系統發育樹（鄰接法）Fig.2 Phylogenetic tree of cultured fungi of yellow sun-cured tobacco curing leaves basing on ITS sequences(neighbor-joining method)

多種真菌制劑已經應用到煙草植株病害防治和煙葉的加工過程。例如任加慶等[34]用8種真菌菌劑處理田間煙草植株葉片發現，其中一種曲霉菌劑ESF-6在煙草病毒病發病高峰期的防效為83.8%。高文霞等[17]從煙葉中分離到一株木霉屬菌株YZ2和曲霉屬菌株SZ14，兩株真菌的菌液處理煙絲后，煙葉香氣前體物質含量增加，感官評吸得分顯著提高。周瑾等[15]從煙葉上分離到一株假絲酵母屬（Candida）菌株Yu-1，將真菌懸液應用到低次烤煙碎片上，經發酵后，能顯著降低烤煙碎片的刺激性，改善吸味。煙葉真菌在整個曬黃煙的調制過程中都有分布，多樣性指數分析顯示，曬黃煙調制期的純培養真菌的多樣性比較豐富，在這些真菌類群中蘊含著豐富的微生物資源，從這些真菌中可以篩選出有益的真菌類群，用以防治煙草病蟲害、提高煙草產量以及改善煙葉品質等。

4 結論

本研究采用PDA和SDA培養基從調制期曬黃煙煙葉中共分離獲得126株真菌，下部和上部煙葉分離的菌株數多于中部煙葉，調制中期分離的菌株數少于調制前期和調制后期。這些菌株分布在2門、5綱、10目、14科、17屬，其中14株菌可能是未確定分類地位的物種。多樣性指數分析顯示，曬黃煙煙葉調制期的純培養真菌類群多樣性比較豐富。所分離的真菌中，93.65%的菌株屬于子囊菌門。優勢屬為附球菌屬、節菱孢屬和鐮孢菌屬，分別占23.02%、13.49%和11.90%。

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