超聲輔助深共熔溶劑提取兩種煙草多酚的方法研究

尚憲超，譚家能，杜詠梅，劉新民，張忠鋒

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

綠色化學是指在制造和應用化學產品時應有效利用（最好可再生）原料，消除廢物和避免使用有毒和危險的試劑和溶劑[1]。自從綠色化學概念被提出以來，新型綠色溶劑的開發一直占據著至關重要的位置。作為綠色溶劑必須符合以下條件：原料易得、沒有毒性、成本低且可生物降解。在過去20年，“綠色溶劑”離子液體因具有蒸汽壓低、不可燃、溶解性和導電性優良、電化學穩定窗口寬等獨特的物理化學性質，在分離技術、生物催化、有機合成和電化學等領域倍受關注[2]。然而，離子液體存在合成過程復雜、提純困難、成本較高等缺點，從而限制了其大規模工業化應用和發展。此外，最新有關離子液體毒理研究表明，吡啶和咪唑類離子液體并非完全“綠色”，其毒性與傳統有機溶劑相當，咪唑類離子液體毒性甚至大于傳統有機溶劑[3-4]。因此，尋找合成簡單、經濟且更為綠色的替代新型綠色溶劑意義重大。

深共熔現象又稱低溫共熔，是指將兩種或兩種以上固體物質加到一起，使其混合物的熔點發生下降的現象。ABBOTT等[5]研究發現，季銨鹽可以和酰胺類化合物形成低溫共熔體系，并稱之為深共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents,DES）。這種溶劑無毒性，可生物降解，且合成過程中原子利用率達100%，是一種新型的綠色溶劑。深共熔溶劑是由兩到三種成本低、無毒的物質通過氫鍵作用構成，其具有離子液體的優良物理化學性質，并具備生物可降解性、合成路線簡單等離子不具備特點。因此，深共熔溶劑一經發現就迅速進入人們的視線，并在電化學、化學合成、納米材料制備、提取分離等領域中得到廣泛的應用[6]。

煙草作為一種重要經濟作物，含有相當豐富的有機化合物。煙葉中目前被鑒定的化學物質約有2549種，多酚是其中一類重要物質[7-9]。目前煙草中發現多酚類化合物包括單寧類（綠原酸及其衍生物、咖啡酸等），香豆素類（莨菪亭），黃酮類（蕓香苷等）和簡單酚類衍生物等，其中綠原酸、蕓香苷是煙草中最主要的酚類化合物。多酚類化合物是煙草中重要指標化合物，一般優質的煙葉含有較多的綠原酸和蕓香苷。另外，多酚類化合物還是一類重要生物活性物質，綠原酸、蕓香苷具有抗氧化和降低自由基活性的功能，并在食品抗氧化劑，抗心血管病、癌癥、人體衰老藥物中有著廣泛應用[10-11]。

目前，煙草多酚分析方法中使用的仍是傳統的有機溶劑法，即有機溶劑浸提、分析檢測[12-14]。這種提取技術無法避免使用大量有機溶劑，而使用有機溶劑不符合當前化學領域中提倡的可再生、環境兼容和可持續發展的新理念。因此本研究致力于發展一種綠色溶劑高效、快速檢測煙草多酚的方法。首先比較了深共熔溶劑種類及含水量對提取結果的影響。然后通過正交試驗方法優化重要的參數（溫度、時間和料液比）。最后，還研究了從DES溶劑中回收活性化合物的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：Waters UPLC H-CLASS超高壓液相色譜儀；萬分之一電子天平；IKA磁力攪拌器；KQ-500GVDV型雙拼恒溫數控超聲波發生器。

試劑：氯化膽堿、葡萄糖、乳酸、乙二酸、尿素、蘋果酸、丙三醇、甜菜堿、脯氨酸為化學純，購買于阿拉丁試劑公司；乙二醇、丙二酸、1,4-丁二醇為化學純，購買于國藥集團化學試劑公司；綠原酸、蕓香苷為分析純，購買于上海源葉生物科技有限公司；Waters Oasis HLB固相萃取柱，購買于Waters公司；甲醇為色譜純，購買于德國MERCK公司。

1.2 材料的預處理

將新鮮煙葉（品種為紅花大金元，由云南省大理市試驗站提供）于60℃烘干，制成40目粉末，4℃冰箱中貯存，作為綠原酸、蕓香苷提取的原料。

1.3 色譜條件

分析條件：流動相A為甲醇，流動相B為0.5%醋酸水溶液。梯度洗脫程序：0～5 min，18%A，82%B;5～6 min，18%～40%A，82%～60%B;6～9 min，40%～90%A，60%～10%B;9～11 min，90%～100%A，10%～0%B;11～14 min，100%～60%A，0%～40%B;14～15 min，60%～18%A,40%～82%B。BEH C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速 0.3 mL/min；進樣量 3 μL；柱溫 35 ℃；檢測波長340 nm。

標準曲線：稱取綠原酸純品111.8 mg、蕓香苷13.3 mg，用50%甲醇水溶液溶解并定容至100 mL容量瓶中。將上述溶液轉移到200 mL容量瓶中，并用甲醇定容。分別吸取上述溶液1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 mL于100 mL容量瓶中，用50%的甲醇溶液定容，配置成系列標準溶液。利用UPLC法，以峰面積對質量濃度做標準曲線。在此質量濃度范圍內，綠原酸的線性回歸方程為Y=16099X-41253（R2=0.999，n=6），標準曲線的線性范圍為5.59～89.44 μg/mL；蕓香苷的線性回歸方程為Y=13115X+958.9（R2=0.999，n=6），標準曲線的線性范圍為0.67～10.64 μg/mL。

綠原酸、蕓香苷質量分數的測定方法：綠原酸、蕓香苷的測定采用YC/T202—2006煙草及煙草制品多酚類化合物綠原酸、莨菪亭和蕓香苷的測定。標準品及樣品中目標化合物的色譜分離圖如圖1所示，化學結構[9,11]如圖2所示。

圖1 綠原酸（A）及蕓香苷（B）標準溶液（1）和煙草樣品（2）色譜分離圖Fig.1 UPLC chromatograms of the standards(1)and target compounds(2):Chlorogenic acid(A),rutin(B)

圖2 綠原酸及蕓香苷化學式Fig.2 The structures of target phenolic compounds

1.4 試驗方法

1.4.1 深共熔溶劑制備 深共熔溶劑由氯化膽堿（甜菜堿或脯氨酸）與不同氫鍵供體（葡萄糖、乳酸、乙二酸、蘋果酸、乙二醇、丙二酸、1,4-丁二醇、尿素）加熱攪拌生成。分別稱取氯化膽堿7.0 g（50 mol）、葡萄糖9.0 g（50 mol）放置于100 mL圓底燒瓶中，80℃下磁力攪拌4～6 h，得到無色透明液體，之后冷卻至室溫，制得新型低共熔溶劑。然后分別稱取不同質量乳酸、乙二酸、蘋果酸、乙二醇、丙二酸、1,4-丁二醇、尿素，依照上述制備方法，分別與氯化膽堿合成不同類型深共熔溶劑[15]。

1.4.2 提取方法 準確稱取10 mg煙末置于提取器中，加入1 mL深共熔溶劑，混勻，一定條件下超聲萃取，然后用50%甲醇將提取液定容至10 mL，濾膜過濾，取1 mL濾液用色譜儀器分析。每個樣品均重復檢測2次。優化條件包括：深共熔溶劑種類、含水量（0～50%）、料液比（1∶25～1∶200）、溫度（30～60℃）及時間（10～50 min）。

1.4.3 DES提取液中多酚的回收 活化好的固相萃取柱（Waters Oasis HLB）裝入2 mL的DES提取液并洗脫。首先用去離子水清洗直至DES全部洗脫。然后用甲醇（50 mL）洗脫，收集組分用旋轉蒸發儀旋干。樣品用10 mL 50%甲醇溶解，用于液相色譜分析。

2 結果

2.1 深共熔溶劑種類對綠原酸、蕓香苷提取量的影響

深共熔溶劑的組成對其理化性質（極性、粘度和溶解性）有很大的影響，而這些理化性質直接影響目標化合物的提取效率[16-18]。為了選擇一個適合煙草多酚提取的深共熔溶劑，本研究共合成11種深共熔溶劑，其組成及摩爾比如表1所示。11種深共熔溶劑按氫鍵供體分成4類：氯化膽堿-丙三醇、氯化膽堿-1,4-丁二醇、氯化膽堿-尿素-丙三醇、甜菜堿-丙三醇、脯氨酸-丙三醇，氫鍵供體為多元醇；氯化膽堿-尿素，氫鍵供體為酰胺類；氯化膽堿-葡萄糖，氫鍵供體為糖類；氯化膽堿-乳酸、氯化膽堿-丙二酸、氯化膽堿-乙二酸、氯化膽堿-蘋果酸，氫鍵供體為羧酸類。

表1 深共熔溶劑組成Table 1 Composition of the DESs

超聲輔助提取條件下，溫度設定40℃、提取時間為30 min，水/深共熔溶劑體積比為4/6（V/V），并以傳統有機溶劑甲醇-水為比對。結果如圖3所示，氫鍵供體為羧酸類時（DES-4、DES-6、DES-7），深共熔溶劑對綠原酸提取效率明顯優于氫鍵供體為多元醇、糖類、酰胺類深共熔溶劑。其中，DES-4、DES-6提取效率與甲醇-水相當，最優為氯化膽堿-蘋果酸（DES-7）。而蕓香苷結果表明，氯化膽堿-葡萄糖（DES-1）、氯化膽堿-丙三醇（DES-3）、氯化膽堿-1,4-丁二醇（DES-4）、氯化膽堿-蘋果酸（DES-7），這4種深共熔溶劑提取效率更高。選取氯化膽堿/蘋果酸作為提取溶劑，40%（V/V）的水為輔助溶劑，提取溫度為40℃，提取時間為30 min條件下，綠原酸、蕓香苷提取量分別為（16.12±0.62）、（8.53±0.52） mg/g。

2.2 深共熔溶劑含水量對綠原酸、蕓香苷提取量的影響

文獻報道，DES溶劑應用于橄欖油中酚類化合物分離過程中，含水量影響顯著，合適的水含量可以提高提取效率[19]。在相同的超聲輔助提取條件下，溫度設定50℃、提取時間為20 min，如圖4a，加入一定體積水后，目標化合物的提取率增加1.1～1.4倍。40%（V/V）含水量的深共熔溶劑對綠原酸及蕓香苷的提取率最高。

2.3 提取溫度、時間、料液比

圖3 深共熔溶劑種類對綠原酸及蕓香苷提取量的影響Fig.3 The effect of DES on the extraction of two target phenolic acids from tobacco

圖4 不同含水量（a）、溫度（b）、時間（c）和料液比（d）對兩種多酚提取量影響.Fig.4 Concentrations of the two phenolic compounds a at different water content in DES,b at different temperatures c for different

如圖4b，在其他條件不變情況下，溫度30～50℃范圍內，綠原酸及蕓香苷提取量隨溫度升高略微增加，在50℃時達到最大值。隨著溫度繼續升高，2種多酚提取量無明顯變化；如圖4c，時間5～20 min范圍內，綠原酸及蕓香苷提取量隨時間的延長而升高，到20 min時接近最大值。再隨著時間延長，2種多酚提取量無明顯變化；如圖4d，料液比1∶25～1∶100范圍內，綠原酸及蕓香苷提取量隨料液比的增大而升高，到1∶100時接近最大值。

2.4 正交試驗

根據單因素試驗的結果，選取影響煙草多酚提取效果的溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）作為3個考察因素，選取3個水平，采用L9（33）正交表設計正交試驗（表2），對結果進行極差分析，以確定最佳的提取條件。

表2 深共熔溶劑提取煙草多酚正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels for L9(33)orthogonal array design

綠原酸正交試驗結果見表3。由表3的極差（R）分析結果可以看出，RB＞RA＞RC，3個因素對煙草綠原酸的提取率影響大小依次為萃取時間（B）＞萃取溫度（A）＞料液比（C）。3因素中，萃取時間與萃取溫度的影響較為顯著，其中，萃取時間的提取作用最為顯著。在實驗設計范圍內，優化得到深共熔溶劑提取煙草綠原酸的最佳條件為A2B3C2，即萃取溫度50℃、萃取時間30 min、料液比1∶100。蕓香苷正交試驗結果見表4。由表4的極差分析結果可以看出，RB＞RC＞RA，3個因素對蕓香苷的提取率影響大小依次為：萃取時間（B）＞料液比（C）＞萃取溫度（A）。3因素中，萃取時間與料液比的影響較為顯著，其中，萃取時間的提取作用最為顯著。在實驗設計范圍內，優化得到深共熔溶劑提取煙草綠原酸的最佳條件為A2B3C2，即萃取溫度50℃、萃取時間30 min、料液比1∶100。

2.5 活性化合物回收

固相萃取柱（Waters Oasis HLB）對酚酸有良好的吸附和解吸能力，被用于從DES提取液中回收兩種酚類化合物。在洗脫過程中，由于DES溶劑的強極性和水溶性，DES溶劑首先被水洗脫。而進一步用醇類溶劑洗脫可回收酚類化合物。結果顯示，綠原酸、蕓香苷的回收率分別為91.67%和99.81%，綜合提取率為99.86%。證明了酚類化合物可以從DES提取物中有效地回收。水相洗脫液旋蒸除去溶劑后，除部分煙草水溶物（煙草糖類、生物堿、有機酸及無機離子）外，大部分為深共熔溶劑，如何有效回收深共熔溶劑需今后進一步研究。

表3 深共熔溶劑提取綠原酸正交試驗設計及結果Table 3 L9(33)orthogonal array design and results for chlorogenic acid

表4 深共熔溶劑提取蕓香苷正交試驗設計及結果Table 4 L9(33)orthogonal array design and results for rutin

3 討論

對比不同深共熔溶劑對兩種多酚化合物提取量的影響可以看出，氯化膽堿/蘋果酸組成的DES對兩種多酚化合物的提取效果最優，故本實驗選擇DES氯化膽堿-蘋果酸作為最佳提取溶劑。由于綠原酸和蕓香苷與DES氯化膽堿-蘋果酸均存在較強的氫鍵相互作用，兩種煙草多酚能夠快速分散到DES中，因此采用DES氯化膽堿-蘋果酸進行綜合提取。艾心靈等[13]用95%乙醇進行綜合提取，提取率僅為93.65%，提取率較低，提取溫度較高（80℃），提取時間較長（90 min）。而本方法采用氯化膽堿-蘋果酸組成的DES對煙草中綠原酸、蕓香苷進行綜合提取，具有較短的提取時間（30 min）、較低的提取溫度（50℃）以及較高的提取率（99.86%）。由于DES綠色無毒，本提取方法有望實現煙草中活性成分的規模化制備。研究中發現，本方法所用DES粘度差異較大，DES粘度影響多酚化合物提取效果的規律，需今后進一步探究。

4 結論

新型綠色溶劑——深共熔溶劑被首次應用于煙草多酚類化合物提取。結果表明，深共熔溶劑是一種理想的有機酸的提取溶劑，能有效提高酚酸類物質的溶解性。經過條件優化后，深共熔溶劑氯化膽堿-蘋果酸具有較高的提取效率。最佳條件為：DES中水含量為40%，料液比為1∶100，提取溫度50℃，提取時間30 min。該條件下，綠原酸、蕓香苷提取量達到最優，分別為（16.95±0.69）、（8.53±0.52） mg/g。

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