低頻超聲聯合微泡及腦源性神經營養因子預防治療大鼠缺血性卒中

王 毅，王 凌，康紹軍*，曾 桂

(1.重鋼總醫院神經外科，2.放射科，3.超聲科，重慶 400081)

腦卒中是全球第二大死亡原因和成人致殘的首要原因[1],其中缺血性腦卒中發病率最高，我國的發病率約為43.70%～78.90%[2]。目前,缺血性腦卒中的臨床治療，除于發病急性期6 h以內溶栓以及后期功能鍛煉外，尚無更有效的治療措施。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)是神經生長因子家族成員之一，具有保護神經元、減少神經元凋亡、促進神經元在有害環境下生存等作用[3-5]。BDNF治療實驗性卒中，可促進卒中后神經功能恢復，改善卒中預后[6]。正常血腦屏障(blood brain barrier， BBB)通透性低，外周大分子物質很難通過BBB進入中樞神經系統[7]。另外，外周血液系統內存在的BDNF內切酶，導致BDNF半衰期短，劑量不穩定，限制其臨床應用[6]。研究[8]顯示，卒中后靜脈注射5 μg BDNF對大鼠梗死范圍無保護作用，而對BDNF進行化學修飾后，可與BBB上轉鐵蛋白受體(transferrin receptor， TfR)結合，進入大腦發揮保護作用。近年研究[9]表明,超聲聯合微泡可以靶向開放BBB，使得大分子藥物有機會直接通過BBB進入特定區域發揮治療作用，從而簡化或省去藥物的化學修飾過程。筆者應用這一效應實現BBB早期開放，對大腦中動脈梗阻(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型預防性靜脈注射BDNF，旨在評價其對急性缺血性腦卒中缺血部位的預防性治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠27只，體質量約200～300 g(購自第三軍醫大學實驗動物中心)，隨機分為假手術組、BDNF組、BDNF超聲組，每組動物9只。飼養室內溫度(22±1)℃,12 h循環黑白照明，自由取食與飲水。所有動物飼養的設施和環境遵照國家標準《實驗動物環境及設施》(GB14925-2001)，飼養管理和實驗操作符合《北京市實驗動物管理條例》的有關標準。本實驗經我院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 MCAO模型的建立及治療 術前12 h實驗動物禁食不禁飲。經尾靜脈緩慢推注2.5%戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich公司)2.5 mg/kg體質量進行麻醉，將實驗動物仰臥保定于解剖臺，頸部備皮并消毒。于頸部正中切口，暴露頸前肌，沿右側胸鎖乳突肌間隙分離肌肉組織，分離暴露右側頸總動脈(common carotid artery, CCA)、頸內動脈(internal carotid artery， ICA)和頸外動脈(external carotid artery， ECA)。結扎ECA近心端和遠心端，中間剪斷，暫時夾閉ICA、CCA。將尼龍線插入ECA，用5-0絲線用力結扎，打開ICA處動脈夾，將尼龍線插入ICA，繼續插入顱內至微感阻力，插入深度約(18.5±0.5)mm，使尼龍線頭端通過大腦中動脈起始處，到達較細的大腦前動脈，結扎ECA、固定尼龍線并防止出血。阻斷1 h后退出尼龍線進行再灌注，5-0慕絲線結扎ECA，逐層縫合。術后連續3天注射青霉素鈉(山東魯抗醫藥股份有限公司),每天2.5萬U/kg體質量。

假手術組：只進行術前麻醉和血管分離術，不結扎及導入線栓；BDNF組：在模型建立前通過尾靜脈預防性注射50 μg BDNF(Sigma-Aldrich公司)，不進行超聲輻照；BDNF超聲組：經尾靜脈注入50 μg BDNF和2 ml超聲造影劑聲諾維(干粉溶于5 ml生理鹽水；SonoVue，Bracco公司)，以超聲診斷儀(HP Sonos-5500型)S3探頭輻照動物顱腦10 min。頻率采用諧波1.7 MHz/3.3 MHz，成像深度3 cm，超聲輸出機械指數為1.0，超聲重復頻率1 Hz。實驗結束后，將動物回籠飼養。術后24 h后每組取3只動物檢測腦組織內BDNF濃度，剩余動物在術后第1、3、7天進行MR檢查并進行行為學評價，最后取腦進行TTC染色。

1.3 ELISA檢測 取各組動物梗死部位相同質量的腦組織，按照W/V=11∶100加入蛋白裂解液充分勻漿并提取蛋白，按照ELISA試劑盒說明書檢測BDNF含量，并計算對應的濃度值。

1.4 MR檢查 采用Agilent 7.0T MR儀(美國安捷倫科技有限公司)。術后第1天行DWI，參數：15層，層厚1 mm，層間距0，TR 2 000 ms, TE 36 ms，回波間隔時間10 ms, 平均次數20, FOV 30 mm× 30 mm，矩陣128×128。術后第3天和第7天采用FSEM T2W序列掃描，參數：15層，層厚1 mm，層間距0，TR 2 524 ms, TE 20 ms，回波間隔時間 20 ms,平均次數16，FOV 40 mm×40 mm，矩陣196×196。

1.5 TTC染色 經生理鹽水灌注后取腦，保持大腦的完整性。-20℃冰箱中速凍20 min左右，用專用腦槽，將大腦切片，然后置于0.05%新鮮配置的TTC中，37℃避光孵育15～30 min，PBS洗3次，每次約1 min，多聚甲醛固定30 min～24 h。

1.6 行為學評價 術后第1天、第3天和第7天，采用改良的Bederson評分對大鼠進行行為學評價。0分，行為完全正常；1分，提起鼠尾離開地面，對側前肢內旋、內收；2分，放至地面，手術對側抗力下降者；3分，觀察其行走，圍繞手術對側轉圈者；4分，無法自主活動者。

1.7 統計學分析 采用SPSS 14.0統計分析軟件。計量資料以±s表示，3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗。3組行為學評分的比較采用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦組織內BDNF含量 術后24 h，3組間腦組織BDNF水平比較差異均有統計學意義(F=22.83，P均<0.05)，兩兩比較示BDNF組 [(79.8 ± 20.8)pg/ml]、BDNF超聲組[(127.0 ± 22.9)pg/ml]腦組織BDNF水平均高于假手術組[(46.9 ± 17.9)pg/ml](P均<0.05)；BDNF超聲組高于BDNF組(P<0.05)。

2.2 腦梗死面積 BDNF組：隨著時間的延長，高信號梗死區域逐漸增大，術后第7天梗死區面積基本接近半個腦。BDNF超聲組：隨著時間的延長，高信號梗死區域面積逐漸縮小，術后第7天時，梗死區面積小于術后第1天和第3天。術后第7天BDNF超聲組梗死區面積比BDNF組小，水腫較BDNF組輕(圖1)。腦組織TTC染色示術后第7天BDNF超聲組白色缺血梗死區面積明顯較BDNF組小(圖2)。

2.3 行為學評價 術后第1天、第3天，BDNF組和BDNF超聲組行為學評分差異無統計學意義。術后第7天，BDNF超聲組的行為學評分明顯低于BDNF組(P<0.05)，見圖3。

圖1 大鼠腦部冠狀位MRI顯示梗死灶區域為高信號區 術后第1天、第3天、第7天假手術組(A～C)、BDNF組(D～F)和BDNF超聲組(G～I) 圖2 術后第7天腦組織TTC染色圖 A.假手術組; B.BDNF組; C.BDNF超聲組 (白色區域為梗死灶)

圖3 術后第1天、第3天和第7天,假手術組、BDNF組和BDNF超聲組大鼠Bederson評分隨時間的變化曲線

3 討論

我國腦血管病的患病率高，臨床死亡率高，后遺癥多。BDNF作為潛在的藥物分子，被用來治療包括缺血性卒中等多種神經系統疾病。抑制或因敲除BDNF可擴大卒中梗死體積，應用BDNF治療實驗性卒中，可促進卒中后神經功能恢復，改善卒中預后[3-5]。外周血液系統存在BDNF內切酶，導致外周給藥半衰期短，劑量不穩定。因此，BDNF安全、穩定、高效地跨越BBB到達靶區，是BDNF治療缺血性腦卒中的關鍵。

BBB是維持中樞神經系統內環境穩定的重要結構，很多治療中樞神經系統疾病的藥物由于BBB的作用而難以在腦組織達到有效濃度，不能充分發揮療效[10]。目前跨越BBB給藥的方式主要有4種：①穿顱路徑或經鼻路徑給藥，但易損傷腦組織及并發感染等；②利用甘露醇等前體藥物開放BBB[11]，促進藥物進入腦組織，但此方式彌散性開放全腦的BBB，藥物會對正常組織造成影響；③對藥物進行脂溶性化學修飾、改變分子量大小和電荷以促進其跨BBB[12]，但給藥效率較低；④利用高分子藥物載體，如脂質體，但載體的載藥量較低，難以達到治療濃度。

研究[9]表明，超聲微泡介導聲孔效應可以靶向性、可逆性開放BBB，引起BBB通透性暫時增加，同時并未引發局部腦組織的明顯損傷。已有研究[13-14]證實，低頻診斷超聲可穿透顱骨準確聚焦開放BBB，同時微泡的應用大大降低了超聲的空化閾值。Fan等[15]將微泡同伊文思藍染料共同經靜脈注射到動物體內，結果發現超聲照射區域內伊文思藍染料的溢出率明顯高于非照射區域，而單獨超聲照射的對照組雙側無明顯變化；實驗中各組均無出血或其他腦實質損害。

本研究對MCAO動物模型預防性使用BDNF，并通過超聲微泡介導的BBB靶向開放效應，提高BDNF的局部濃度，驗證其對中樞神經系統疾病的預防性治療作用。結果發現，在治療后24 h，BDNF超聲組腦組織中BDNF含量明顯高于BDNF組及假手術組，提示超聲促進了藥物在治療區的聚集。另外，本研究還發現BDNF組腦組織中BDNF含量高于假手術組，可能隨著腦缺血的發展，BBB逐漸被破壞，血液循環中BDNF部分進入了梗死區域。BDNF超聲組MRI上高信號梗死區面積隨時間逐漸縮小，第7天時，其梗死區域小于第1天和第3天。與BDNF組比較，BDNF超聲組梗死區域也明顯縮小，且水腫較輕。盡管BDNF可以隨著BBB破壞而進入梗死區，但隨著藥物在血液中的降解，進入梗死區的BDNF尚不能達到有效的治療劑量，故BDNF組的梗死面積與BDNF超聲組比較具有較大的差異。TTC染色結果與MRI結果一致。行為學結果顯示，術后第7天BDNF超聲組的評分明顯低于BDNF組。均提示BDNF對神經系統具有明顯的保護和治療作用，并且超聲微泡介導的聲孔效應開放了目標區域的BBB，提高了藥物在靶區的治療濃度，促進了神經功能的恢復。

綜上所述，本研究觀察BDNF在超聲介導下對MCAO大鼠模型的治療作用，為缺血性腦損傷等中樞神經系統疾病的治療提供了一種高效、無創、安全的治療方法。

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