銀杏葉色素超聲輔助提取工藝優(yōu)化及其穩(wěn)定性研究

李 玲LI Ling 閆旭宇 -

(1. 湖南科技學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，湖南 永州 425199；2. 湖南省銀杏工程技術(shù)研究中心，湖南 永州 425199；3. 延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬植物，現(xiàn)代化學(xué)及藥理研究表明，銀杏葉的活性成分主要是黃酮類化合物和萜內(nèi)酯類化合物[1]，具有抗氧化、抑制血小板聚集、擴(kuò)張動(dòng)脈血管、降血糖、調(diào)血脂等藥理作用，在臨床上用來(lái)治療血栓、炎癥和心血管疾病[2]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后對(duì)銀杏化學(xué)成分[3]、藥理作用[4]及臨床應(yīng)用[5]做了大量研究，主要集中在黃酮、內(nèi)酯及多糖的分離純化，以及相關(guān)制劑的制備生產(chǎn)方面，但關(guān)于銀杏葉色素提取及其穩(wěn)定性方面的研究報(bào)道比較少。劉詠等[6]曾采用洗濾法對(duì)銀杏色素進(jìn)行提取并研究其穩(wěn)定性；文赤夫等[7]曾采用石油醚浸提法對(duì)銀杏色素進(jìn)行提取并研究其穩(wěn)定性；趙磊等[8]曾采用微波法、水浴法、超聲波提取法對(duì)銀杏黃色素進(jìn)行提取并研究其染色性能。目前，還未見(jiàn)利用超聲輔助乙醇提取銀杏色素穩(wěn)定性方面的報(bào)道。

由于不同方法提取的銀杏色素穩(wěn)定性有一定的差異。同時(shí)，考慮到銀杏葉色素作為天然食品著色劑的用途，本研究擬采用超聲輔助乙醇提取銀杏葉色素，利用正交試驗(yàn)優(yōu)化銀杏葉色素的提取工藝，并研究了酸、堿、熱、金屬離子和光照等因素對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性的影響，以期為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)銀杏資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

銀杏葉：采自湖南永州桐子坳；

無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣、氯化銅、氯化鐵：分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱：WG-71型，天津市泰斯特儀器有限公司；

中草藥粉碎機(jī)：FW177型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電子分析天平：JA3003型，上海舜宇恒平科技儀器有限公司；

可見(jiàn)分光光度計(jì)：721型，浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK-98-ⅡA型，上海百典儀器設(shè)備有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：YRE-2010-Ⅱ型，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；

超聲波清洗儀：BL3-120型，上海比朗儀器制造有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏葉色素的提取 新鮮銀杏葉于60 ℃干燥至恒重，粉碎過(guò)80目篩，放入50 mL錐形瓶中，加入乙醇，搖勻，在一定溫度下超聲(300 W)輔助浸提，離心過(guò)濾取上清液，即為銀杏葉色素提取液。

1.2.2 銀杏葉色素吸光度的確定 取10.0 mL色素提取液，蒸餾水稀釋并定容至100 mL，用可見(jiàn)分光光度計(jì)在420～450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸收光譜，確定其最佳吸收波長(zhǎng)。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

(1) 乙醇濃度的選擇：固定溶液pH值6.0、料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min，乙醇濃度分別設(shè)置為80%，85%，90%，95%，100%，平行試驗(yàn)3次，研究乙醇濃度對(duì)銀杏葉色素吸光度的影響。

(2) 料液比的選擇：固定溶液pH值6.0、乙醇濃度95%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min，料液比分別設(shè)置為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 (g/mL)，平行試驗(yàn)3次，研究料液比對(duì)銀杏葉色素吸光度的影響。

(3) pH值的選擇：固定乙醇濃度95%、料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間90 min，pH值分別設(shè)置為4，5，6，7，8，平行試驗(yàn)3次，研究pH值對(duì)銀杏葉色素吸光度的影響。

(4) 提取溫度的選擇：固定溶液pH值6.0、乙醇濃度95%、料液比1∶20 (g/mL)、提取時(shí)間90 min，提取溫度分別設(shè)置為40，50，60，70，80 ℃，平行試驗(yàn)3次，研究提取溫度對(duì)銀杏葉色素吸光度的影響。

(5) 提取時(shí)間的選擇：固定溶液pH值6.0、乙醇濃度95%、料液比1∶20 (g/mL)、提取溫度60 ℃時(shí)，提取時(shí)間分別設(shè)置為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，平行試驗(yàn)3次，研究提取時(shí)間對(duì)銀杏葉色素吸光度的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇4個(gè)影響較大的因素作為正交試驗(yàn)因素，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，得出超聲輔助乙醇提取銀杏葉色素的最佳工藝條件。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

(1) 酸堿對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性影響：準(zhǔn)確吸取1 mL銀杏葉色素提取液，定容至10 mL，用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值分別為2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，靜置1 h，在最佳波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

(2) 溫度對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性影響：準(zhǔn)確吸取1 mL銀杏葉色素提取液，定容至10 mL，分別在20，30，40，50，60，70，80，90 ℃水浴30 min，在最佳波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度值。

(3) 金屬離子對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性影響：準(zhǔn)確吸取5 mL銀杏葉色素提取液，分別置于5支試管中，與0.1 mol/L的Na+、Mg2+、Cu2+、Fe3+、Ca2+溶液以1∶1的體積比振蕩混合，室溫靜置6 h，在最佳波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

(4) 光照對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性影響：準(zhǔn)確吸取2 mL銀杏葉色素提取液，定容至20 mL，靜置，分別在日光、室內(nèi)光和避光條件下保存2，4，6，8，10 h，在最佳波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏葉色素最佳吸收波長(zhǎng)的確定

如圖1所示，銀杏葉色素特征吸收峰為435～450 nm，本試驗(yàn)確定銀杏葉色素的最佳吸收波長(zhǎng)為445 nm。

圖1 銀杏葉色素的吸收波長(zhǎng)

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度的確定 由圖2可知，隨乙醇濃度的增加，銀杏葉色素的吸光度值呈上升趨勢(shì)，在乙醇濃度為95%時(shí)達(dá)到最高。可能是由于該色素易溶于乙醇，在浸提液中的溶解率隨著乙醇濃度的增加而逐漸升高。然而，當(dāng)采用無(wú)水乙醇浸提，即乙醇濃度達(dá)到100%時(shí)，色素提取液的吸光值略有降低。可見(jiàn)，用有一定含水量的乙醇來(lái)提取銀杏葉色素效果更好，但水分過(guò)多會(huì)導(dǎo)致溶解度下降。因此，初步確定乙醇濃度為95%。

圖2 不同乙醇濃度下色素的吸光度值

2.2.2 料液比的確定 由圖3可知，隨著溶劑的增加，銀杏葉色素的吸光度值先上升后下降。料液比為1∶20(g/mL)時(shí)，吸光度值最高，表明銀杏葉色素在料液比1∶20(g/mL)的條件下已基本溶出。料液比太大，銀杏葉粉末與浸提液接觸不充分，不利于色素全部溶出；料液比太小，則浸提液過(guò)多，雖然色素的溶出更加充分，但不利于后期濃縮[9]，并且還會(huì)引起其它物質(zhì)溶出，使銀杏葉色素有效濃度降低，導(dǎo)致吸光度下降[10]。因此，料液比以1∶20 (g/mL)為宜。

圖3 不同料液比下色素的吸光度值

2.2.3 pH值的確定 由圖4可知，隨著pH值的增加，銀杏葉色素的吸光度值先上升后下降，在pH值為6時(shí)，吸光度值最高。說(shuō)明銀杏葉色素在弱酸偏中性條件下溶解度達(dá)到最大，pH值為4和8時(shí)，吸光度值下降，可能是在偏酸或偏堿條件下，色素的發(fā)色基團(tuán)不穩(wěn)定，會(huì)發(fā)生某些化學(xué)反應(yīng)引起吸光度值下降[9]。因此，pH值為6時(shí)提取效果最好。

2.2.4 提取溫度的確定 由圖5可知，隨著溫度的升高，銀杏葉色素的吸光度值逐漸上升，當(dāng)浸提溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，浸提效果最好，之后當(dāng)浸提溫度高于60 ℃時(shí)，吸光度值逐漸下降。說(shuō)明在較低的溫度下，隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)加劇，細(xì)胞膜的通透性和溶劑的滲透能力逐漸增強(qiáng)[11-13]，利于銀杏葉色素的溶出。但如果溫度高于60 ℃，銀杏葉色素對(duì)熱不穩(wěn)定，溫度升高易使色素分解，導(dǎo)致提取效果降低[14]。因此，最佳浸提溫度為60 ℃。

圖4 不同pH值下色素的吸光度值

圖5 不同提取溫度下色素的吸光度值

圖6 不同提取時(shí)間下色素的吸光度值

2.2.5 提取時(shí)間的確定 由圖6可知，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，銀杏葉色素的吸光度值迅速上升，在1.5 h時(shí)達(dá)到最高值，之后如繼續(xù)提取，吸光度略有下降，但浸提效果變化不明顯?？赡苁窃?.5 h時(shí)色素已完全溶出，如果繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，則會(huì)導(dǎo)致溶出色素發(fā)生分解或其它醇溶性物質(zhì)溶出，使銀杏葉色素的有效濃度下降，影響吸光度值的準(zhǔn)確性[15-16]。因此，最佳浸提時(shí)間為1.5 h。

2.3 銀杏葉色素提取條件的優(yōu)化

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇濃度、pH值、提取溫度和提取時(shí)間為正交試驗(yàn)因素，以銀杏葉色素吸光度為指標(biāo)，按照表1的因素水平進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。

由表2可知，影響銀杏葉色素吸光度的主次因素依次為乙醇濃度>pH值>提取溫度>提取時(shí)間，乙醇濃度對(duì)提取率的影響相對(duì)較大。超聲輔助乙醇提取銀杏葉色素的最佳組合為A2B2C2D2，即乙醇濃度95%，pH值6.0，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間2.0 h。在最佳組合條件下設(shè)置3次平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到銀杏葉色素的吸光度值為0.831。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表1銀杏葉色素提取的正交試驗(yàn)因素與水平

Table 1 The orthogonal test variables and levels of pigment extraction from the leaves ofGinkgobiloba

水平A乙醇濃度/%BpH值C提取溫度/℃D提取時(shí)間/h1905．0501．52956．0602．031007．0702．5

表2銀杏葉色素提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 The orthogonal experiment results of pigment extraction from the leaves ofGinkgobiloba

序號(hào)ABCD吸光度111110．783212220．819313330．806421230．821522310．828623120．815731320．796832130．801933210．804k10．8030．8000．8000．805 k20．8210．8160．8150．810k30．8000．8080．8100．809R0．0210．0160．0150．005

2.4.1 酸堿對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性的影響 由表3可知，銀杏葉色素在pH 5～8時(shí)比較穩(wěn)定，在pH 2～4和pH 10～12時(shí)，色素溶液吸光度明顯上升。由此推斷，在弱酸和弱堿性條件下銀杏葉色素的穩(wěn)定性較好，可作為偏中性飲料等食品的著色劑[17]。在偏酸及偏堿條件下不穩(wěn)定，其原因是酸性或堿性條件改變了色素中發(fā)色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致吸光值的明顯變化[9]。因此在銀杏葉色素的開(kāi)發(fā)使用過(guò)程中，要注意酸堿性的影響。

2.4.2 溫度對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性的影響 由表4可知，銀杏葉色素具有一定的耐熱性，在溫度為20～70 ℃時(shí)，吸光度變化不大，80～90 ℃時(shí)，吸光度明顯下降。可能是銀杏葉色素對(duì)熱不穩(wěn)定，在80～90 ℃時(shí)易發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致共價(jià)鍵斷裂引起色素分解，最終引起吸光值下降[18]。因此在制備和儲(chǔ)存銀杏葉色素時(shí)應(yīng)盡量避免長(zhǎng)時(shí)間處于70 ℃以上的高溫。

表3 不同pH值條件下銀杏葉色素的吸光度值

表4 不同溫度條件下銀杏葉色素的吸光度值

表5 不同金屬離子條件下色素的吸光度值

2.4.3 金屬離子對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性的影響 由表5可知，Na+和Ca2+對(duì)銀杏葉色素基本無(wú)影響，Mg2+和Cu2+溶液使銀杏葉色素吸光度值明顯增大，F(xiàn)e3+使銀杏葉色素吸光度值增大最明顯。說(shuō)明銀杏葉色素或某些色素基團(tuán)可能與Mg2+、Cu2+和Fe3+發(fā)生了絡(luò)合反應(yīng)，導(dǎo)致吸光度值增加[19]。因此，在銀杏葉色素加工貯存和應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)盡量避免與Mg2+、Cu2+和Fe3+接觸，這與金屬離子對(duì)烏飯葉、紫色甘薯莖葉和山竹殼色素的穩(wěn)定性研究是一致的[20-22]。

2.4.4 光照對(duì)銀杏葉色素穩(wěn)定性的影響 由圖7可知，避光保存的銀杏葉色素吸光度值明顯高于日光照射和室內(nèi)自然光條件的吸光度值。日光照射對(duì)銀杏葉色素的影響較大，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)色素的吸光度值逐漸下降。室內(nèi)自然光照射對(duì)銀杏葉色素的影響沒(méi)有日光照射明顯，吸光度值隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)緩慢下降。避光保存時(shí)，銀杏葉色素的穩(wěn)定性非常好，保存時(shí)間在0～10 h時(shí)其吸光度值沒(méi)有明顯變化。因此，貯存并運(yùn)輸銀杏葉色素時(shí)應(yīng)盡可能避光或者添加一定的色素穩(wěn)定劑[18]。

圖7 不同光照條件下銀杏葉色素的吸光度值

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超聲輔助乙醇浸提法提取銀杏葉色素，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)影響銀杏葉色素提取效果的因素進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，銀杏葉色素最佳提取工藝條件為：乙醇濃度95%、pH值6.0、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間2 h，此條件下銀杏葉色素的吸光度為0.831。超聲輔助醇提法簡(jiǎn)單易行，乙醇作為提取溶劑安全環(huán)保。

銀杏葉色素在弱酸和弱堿性條件下穩(wěn)定性較好，在偏酸及偏堿條件下不穩(wěn)定；對(duì)金屬離子Na+、Ca2+比較穩(wěn)定，對(duì) Fe3+、Cu2+、Mg2+不穩(wěn)定，在銀杏葉色素生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中應(yīng)盡量避免與Mg2+、Cu2+和Fe3+接觸；70 ℃以上溫度會(huì)促進(jìn)銀杏葉色素分解，在制備和貯存銀杏葉色素時(shí)應(yīng)盡量避免長(zhǎng)時(shí)間處于70 ℃以上的高溫；銀杏葉色素對(duì)日光和室內(nèi)光均不穩(wěn)定，宜避光保存。銀杏葉色素可以作為一種良好的天然食用色素進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用。

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