RANK信號調控破骨細胞分化與成熟的研究進展

梅良偉 桑文華 陳富春 李曉春 王登峰 吳卓 穆佐洲 邵海龍

1.陜西省第四人民醫院骨科，陜西 西安 710043 2.陜西省第四人民醫院病理科，陜西 西安 710043

健康骨骼通過骨的重塑來維持，首先由破骨細胞行使骨吸收功能形成骨吸收陷窩，接著成骨細胞在腔隙內重新成骨，這是一個動態平衡的過程[1]。因此，破骨細胞和成骨細胞的結合在空間和時間上都受到嚴格的調控。破骨細胞是一種具有骨吸收功能的多核巨細胞，其主要來源于骨髓中形成的造血前體細胞。M-CSF和RANKL由成骨細胞或骨細胞表達，為破骨前體細胞分化為成熟破骨細胞所必需[2]。M-CSF刺激破骨前體細胞表面表達RANK(由Tnfrsf11a編碼)，進而使RANKL與其受體RANK結合。Tnfsf11或Tnfrsf11a基因缺失的小鼠表現為嚴重的石骨癥，同時伴有因破骨細胞完全死亡而導致的牙齒脫落缺陷[3]。RANKL-RANK信號也受到骨保護素(osteoprotegerin,OPG)(Tnfrsf11b編碼)的負調控，OPG是RANKL的一個可溶性誘導受體，能夠阻礙RANKL與RANK的結合[4]。

RANK是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族的一名成員，它缺乏激活下游信號分子所需的內在酶活性。因此，RANK必須通過募集配體分子例如TNFR相關性因子(TRAFs)，進而激活MAPKs和NF-κB傳導細胞內信號[5]。RANK信號調控下游信號，從而導致單核細胞/巨噬細胞前體細胞向破骨細胞譜系的分化和成熟破骨細胞的激活。

在RANK信號的起始步驟，RANKL與相應的受體RANK結合導致銜接蛋白如TRAF6的募集，從而形成RANK三聚體，同時快速激活MAPKs、NF-κB和AP-1[6]。繼而通過激活AP-1和協同刺激信號介導的細胞內Ca2+振蕩，放大 NFATc1進行信號傳遞[7]。最終，活化的NFATc1促使破骨細胞基因轉錄從而調控破骨細胞的多核和骨吸收功能。本文中筆者主要闡述目前已知的在這一過程中所涉及的分子機制，以及近期關于RANK信號調控破骨細胞的新發現。

1 RANK信號和TRAF銜接蛋白

RANKL與RANK結合促使RANK形成三聚體并募集銜接蛋白—TRAF6，從而啟動下游信號的級聯放大反應。TRAF家族的其他成員如TRAF2、TRAF3和TRAF5，也可以與RANK結合激活破骨細胞分化所需的轉錄因子。然而，對TRAF6缺陷小鼠的研究[8]表明，TRAF6是主要的銜接蛋白，主要負責RANKL激活引起的信號級聯反應。活化的TRAF6通過激活IκB激酶(IKK)復合體或者非典型蛋白激酶C(aPKC)或TGFβ活化激酶1(TAK1)依賴的磷酸化刺激NF-κB的激活，同時這也是一個需要IKKγ(也被稱為NEMO)泛素化以實現最佳激活的過程[9]。支架蛋白p62結合到TRAF6并與aPKCs相互作用，導致多聚蛋白復合物的形成并調節IKKβ[9]。TRAF6還可與TAK1、銜接蛋白TAK1結合蛋白1(TAB1)和TAB2形成復合物[10]。激活后，TAK1使IKK復合物磷酸化，從而進一步激活NF-κB通路[11]。NF-κB信號對破骨細胞的形成至關重要，有研究表明，NF-κB p50/p52雙敲除小鼠因無法生成破骨細胞而表現出嚴重的骨硬化性疾病[12]。AP-1轉錄因子包括Fos(c-Fos、FosB、Fra-1和Fra-2)、Jun(c-Jun、JunB和JunD)和ATF(ATFa、ATF2、ATF4和B-ATF)家族成員的激活也是通過銜接蛋白誘導c-Fos實現[13]。c-Fos基因敲除小鼠表現為嚴重的骨硬化病[14]。這些結果表明，轉錄因子如NF-κB和AP-1是早期RANKL信號通路重要的下游靶點。銜接蛋白的募集也導致MAPKs的激活，包括c-Jun氮端激酶(JNK)、p38、細胞外信號調節激酶和Akt/PKB[15]。近期有研究[16]發現，激活的C激酶1受體(RACK1)為Trp-Asp40(WD40)重復蛋白家族的一名成員，是破骨細胞分化的必要條件。RACK1充當支架蛋白將TRAF6-TAK1復合物與MKK6而不是MKK3相結合，通過選擇性地促進p38的激活在RANKL誘導的破骨前體細胞向破骨細胞分化過程中起重要作用。此外，考慮到RACK1在RANKL誘導下的表達方式及其與β1、β2整合素亞單位和c-Src之間的關系，RACK1可能參與到破骨細胞的骨吸收功能階段。其他研究[17]表明，Akt、JNK和NF-κB通路的激活需要生長因子受體結合蛋白2(Grb2)—相關性結合-2(Gab2)。此外，磷脂酶Cγ2(PLCγ2)與Gab2形成復合物進而使Gab2磷酸化，同時調節RANK募集Gab2。Lee等[18]的研究表明RANK-TRAF6-Rac1-NADPH氧化酶1依賴途徑產生的活性氧是MAPK激活和破骨細胞形成的必要條件。

2 共刺激信號

在初始階段NF-κB、c-Fos/AP-1和NFATc2誘發NFATc1后，RANK信號與免疫球蛋白樣受體/免疫受體酪氨酸活化基序(immunoglobulin-like receptor/immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)信號共同作用，這導致NFATc1的瀑布樣放大并且移位入核結合到DNA上聯同其他轉錄因子一起上調NFATc1靶基因的轉錄[19]。大量的體內研究證明了NFATc1在破骨細胞形成中的重要作用。在動物實驗中，破骨細胞特定NFATc1條件性敲除小鼠表現出骨硬化和破骨細胞形成抑制[20]。此外，NFATc1不僅調節破骨細胞活性和骨形成，還調節其他生物系統中細胞的活化和發育，如免疫系統、心血管系統和骨骼肌系統[21]。

除了RANK信號，免疫球蛋白樣受體如2型髓系細胞觸發受體(triggering receptor expressed in myeloid cells-2,TREM-2)和破骨細胞相關受體(osteoclast-associated receptor,OSCAR)也可以誘導NFATc1信號[22]。這些免疫受體具有短細胞質尾的特點，并且與銜接蛋白如DNAX-活化蛋白12(DNAX-activation protein 12,DAP12)或Fc受體共同的γ亞基(Fc receptor common γ subunit,FcRγ)相關聯，其中就包含ITAM[19]。當ITAM由于RANKL的刺激發生酪氨酸磷酸化時，一個含有酪氨酸激酶的復合物便形成，這些酪氨酸激酶包括布魯頓酪氨酸激酶(Bruton’s tyrosine kinase,Btk)/Tec、銜接分子B細胞連接蛋白(adaptor molecules B cell linker protein,BLNK)和SLP-76，這些復合物將RANK和ITAM下游信號融為一體，最終激活PLCγ2的磷酸化[23]。Btk和Tec缺陷小鼠由于破骨細胞分化被破壞、RANKL誘導的PLCγ2酪氨酸磷酸化高度抑制而表現為骨硬化表型[23]。同時，由于Btk和Tec缺陷，使得RANKL誘導的Ca2+振蕩在細胞內消失。這表明，Btk和Tec對破骨細胞形成至關重要，并且這些激酶通過PLCγ2和Ca2+信號通路調節NFATc1的激活。當DAP12和FcRγ缺乏時，在細胞內無法檢測到Btk/Tec和BLNK/SLP-76復合物的形成，這表明Tec激酶和BLNK復合物的形成均需要ITAM信號的激活，該復合物可作為連接RANK和ITAM信號的分子開關。近期一項研究[24]表明，在破骨細胞形成過程中由RANKL刺激產生的早期雌激素基因1(EEIG1)能夠與RANK相互作用，并且RANKL刺激后與Gab2、PLCγ2和Btk/Tec激酶相連接。EEIG1敲除導致RANK誘導的破骨細胞形成明顯減少，這是因為RANKL介導的PLCγ2的活化和NFATc1的產生被抑制所引起。在RANKL的刺激下，RANK形成了包括EEIG1、Gab2、PLCγ2和Btk/Tec在內的信號復合物，這表明，EEIG1為一種銜接蛋白同時也是RANK和ITAM信號的連接蛋白[24]。

PLCγ2也通過其高度保守域與RANK相互作用，并且與Gab2和TRAF6形成復合物，從而表現為一種信號依賴方式的磷酸化。ITAM信號與RANK信號一起介導長期的感應性PLCγ2激活。活化的PLCγ2通過分解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸產生1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)，IP3與內質網(ER)表面的IP3受體結合。因此，儲存在內質網中的Ca2+被釋放到胞質中，并誘導產生Ca2+振蕩[25]。NFATc1的誘導也受其亞細胞定位的調控，這依賴于其絲氨酸殘基的磷酸化[26]。在缺乏RANKL刺激的條件下，NFATc1主要由位于細胞質中的活性糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)磷酸化。當RANK信號在其抑制性絲氨酸殘基(GSK-3β的Ser9)處誘導GSK-3β磷酸化后，GSK-3β即被滅活。這使NFATc1通過鈣依賴磷酸酶去磷酸化，隨后轉移進入細胞核。在細胞核中，NFATc1誘導靶基因的表達。在破骨細胞過表達GSK-3β的突變型轉基因小鼠中，由于體內破骨細胞數量的減少以及體外破骨細胞形成和NFATc1感應受損而表現出骨硬化病[27]。此外，抑制3-磷酸肌醇激酶可以降低破骨細胞的形成，減弱NFATc1的表達。GSK-3β因磷酸化增加而失活，Akt在破骨細胞前體中過表達也可以引起NFATc1的表達及其核定位。最近的一項研究[28]表明，PKCβ通過滅活GSK-3β調控NFATc1的激活，從而導致破骨細胞生成。這些結果表明，在破骨細胞分化過程中，GSK-3β/NFATc1級聯信號在RANK信號通路內具有重要作用。

3 破骨細胞分化晚期的主要信號

在RANK信號后期，擴增的NFATc1激活和誘導破骨細胞特異性基因表達，這些基因能夠編碼與破骨細胞分化、融合和功能相關的蛋白。此外，在破骨細胞分化過程中，NFATc1的正性或負性調節因子得到增強或抑制。在RANKL誘導的破骨細胞分化過程中，負性調節因子的表達下調：v-maf肌肉筋膜纖維肉瘤癌基因家族、蛋白B(MafB)、干擾素調節因子-8(IRF8)以及B細胞淋巴瘤6(Bcl6)等在破骨細胞分化過程中抑制NFATc1表達[29-31]。所有負性調節因子都被轉錄抑制因子B淋巴細胞誘導的成熟蛋白1(Blimp1)下調[32]。在破骨細胞分化過程中，Blimp1是由RANKL刺激引起的，而在破骨細胞中缺乏Blimp1的小鼠，由于破骨細胞嚴重破壞而表現出骨硬化表型[33]。最近有研究結果[32]表明，sirtuin 6(Sirt6)是一種核組蛋白去乙酰化酶，通過Blimp1直接抑制抗破骨基因的表達。在造血細胞中，Sirt6的特異性消融可以通過降低破骨細胞的分化而增加骨體積。RANKL誘導的NFATc1上調了Sirt6的表達，而誘導的Sirt6通過抑制MafB與Blimp1的結合，對NFATc1的轉錄產生了積極的調控作用[32]。因此，NFATc1通過誘導其靶基因Blimp1和Sirt6的表達來維持其自身的表達，并下調負調節因子的表達。

樹突狀細胞特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)、液泡質子泵亞單位Atp6v0d2和c-Src底物Tks5等幾種蛋白參與破骨細胞間的融合；其表達受NFATc1與PU.1、小眼畸形相關轉錄因子(MITF)和c-Fos的調控。DC-STAMP缺陷型小鼠表現為中度的骨硬化，這與大量TRAP陽性破骨細胞不同的是雖具有骨吸收功能，但吸收能力不完全[34]。同樣，Atp6v0d2缺陷型小鼠由于缺乏多核TRAP陽性破骨細胞也表現為中度骨硬化；然而，這些小鼠主要是單核TRAP陽性細胞[35]。αVβ3，一種整合素受體，能夠與骨基質中的維甲酸結合，通過募集c-Src酪氨酸激酶的合成導致骨吸收[36]。接下來，c-Src使Syk磷酸化，Syk通過募集DAP12和SLP-76形成銜接蛋白復合物，激活包括Rac在內的小Rho家族GTP酶。這些相互作用通過溶酶體分泌囊泡與細胞質膜融合，導致皺褶邊界膜的形成。至于骨吸收，H離子通過皺褶邊界被泵出，并與Cl離子形成HCl將骨基質分解，同時激活各種水解酶如蛋白酶K、CLC-7氯離子通道和TRAP[7]。

Kim等[37]認為，細胞質內的RANK通過調節破骨細胞的肌動蛋白骨架和存活，特異性地參與破骨細胞的形成和功能。他們使用了一種細胞通透性RANK受體抑制劑(RRI)靶向作用于細胞質內的RANK。RRI肽可阻斷RANKL誘導的破骨細胞形成，并通過Vav3、Rac1和細胞分裂周期42破壞下游RANK信號，從而破壞破骨細胞形成過程中產生的肌動蛋白環。此外，RRI抑制破骨細胞的骨吸收作用和增強破骨細胞的凋亡。RRI肽并不能消除任何TRAF6介導的蛋白激酶級聯反應，亦不能改變NFATc1和破骨細胞特異性基因的表達。這些結果表明，RRI肽作用于NFATc1和破骨細胞形成的高度特異性調控之后，主要作用于破骨細胞形成的晚期，而不影響參與免疫信號等多種信號通路的其他信號分子。

4 總結

RANK信號是調控破骨細胞分化和功能的關鍵分子信號。這一發現使破骨細胞在體外培養過程中能夠產生幾乎純合的種群，從而促進了對包括細胞分化和功能在內的細胞內機制和信號網絡的解析。該信號始于RANKL與RANK的結合，并通過募集大量的銜接蛋白如TRAF6和激酶形成一系列的信號復合物，從而促進信號轉導的調節。RANK信號與免疫受體/ITAM信號相互作用，這是破骨細胞生成所需的另一個信號通路。RANKL信號與ITAM介導的Ca2+信號一起，最終誘導NFATc1的擴增和破骨細胞相關基因的表達。正因如此，針對這些信號的分子藥物，不僅會抑制破骨細胞的生成，也可能對其他系統如免疫系統造成影響，探討破骨細胞生成、分化及功能的機制，尋找真正的特異性靶基因及靶分子尤為關鍵。然而，關于共同分子的調節以確保破骨細胞形成所需的特定信號轉導方式尚不清楚。因此，通過對RANK信號通路機制的探討，TRAF6、ITAM、Ca2+以及NFATc1等作為調控破骨細胞分化與成熟的潛在新靶點，將為今后骨科相關疾病的診治和藥物研發提供新的選擇。