骨靶向治療研究進展

譚喬燕 謝楊麗 李燦 羅鳳濤 陳林

陸軍軍醫大學大坪醫院康復理療科/骨代謝與修復中心/全軍戰創傷中心創傷實驗室/創傷、燒傷、復合傷國家重點實驗室，重慶 400042

骨骼不僅是生物體重要的力學支持器官，也是機體的鈣磷庫，對維持體內鈣磷的穩定發揮重要作用。骨形成過程中，間充質干細胞的增殖和密集，然后逐步分化為成骨細胞，成骨細胞分泌類骨質，并被包埋其中，成為骨細胞，繼而類骨質鈣化成骨基質，最后形成骨組織。成骨過程中，成骨細胞還可以通過分泌核轉錄因子受體、骨保護素和巨噬細胞集落刺激因子等來調控破骨細胞的分化和激活。骨重建是維持成年期骨代謝和力學功能的重要機制，需要成骨細胞誘導的骨形成作用和破骨細胞誘導的骨吸收間的動態平衡來實現。任何一方數量或功能的變化必然破壞骨代謝的動態平衡，影響骨代謝，嚴重時可引起骨質疏松、佩吉特病、轉移性骨腫瘤等疾病[1]。

1986年Pierce等[2]首次提出“骨靶向”概念。為骨骼相關疾病的治療提供了新策略。靶向遞送不僅提高藥物利用率，還能減輕藥物毒副作用。本文根據靶向目標不同將骨骼靶向藥物遞送系統分為兩種，一種是靶向整個骨組織；另一種是靶向骨組織里的細胞。

1 靶向骨組織

骨組織干重的35%是天然有機成分膠原，其余主要由無機羥基磷灰石[Ca10(PO4)6(OH)2,HA]構成[3]，所含鈣占人體總鈣量的99%。部分化合物分子可摻入HA同骨組織中鈣結合，從而沉積于骨。因此，凡與HA有特異親和力的物質，都可作為骨組織靶向藥物或靶向載體，從而使藥物能特異性地作用于骨組織。

1.1 四環素類(tetracyclines,TCs)

TCs通過替換HA中的2個PO43-，與Ca2 +絡合形成金屬配合物，從而沉積于骨組織并摻入到新生骨或牙齒中。Wang 等[4]將聚乳酸-羥基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic acid,PLGA)]的末端羧基與骨靶向基團TC的羥基進行酯化反應得到TC-PLGA復合物，異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記TC-PLGA發現納米粒能較好的被靶向組織攝取，在骨組織中的分布比普通納米粒提高80.6%。此外，TCs也可連接藥物作為骨靶向藥物的載體。如將四環素中三羰基甲烷環A與雌二醇結合，三羰基甲烷環A選擇性結合雌激素受體α，從而將雌二醇傳遞并聚集在骨組織，減少其在非骨組織的蓄積與作用，提高雌二醇治療絕經后骨質疏松的安全性[5]。

1.2 雙膦酸鹽類 (bisphosphonates,BPs)

BPs是天然焦磷酸的類似物，分子結構中的兩個末端磷酸鍵(P-C-P)是靶向骨組織的必要條件。 磷酸基對鈣化組織有較強親和力，可與骨表面HA有效結合，抑制HA的繼續形成、聚集及溶解，從而抑制骨吸收[6]，因此，BPs可作為藥物單獨用于治療骨質疏松癥、佩吉特病及轉移性骨腫瘤等骨吸收增多性疾病[1]。但使用前對腎功能的要求及其可能導致的腎毒性、頜骨壞死、骨關節疼痛等癥狀在一定程度上限制了其臨床應用。因此，迫切需要對BPs進行修飾提高其利用率。納米粒是研究比較成熟的藥物載體，由于其親水表面和小粒徑特性，一方面使其避免巨噬系統的吞噬識別；另外還可延長其在血液中的循環時間。Katsumi等[7]研究發現阿侖膦酸經聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)納米粒包裹后顯著提高在血液中的循環時間和靶向骨的能力。Rawat 等[8]將BPs經PEG-PLGA納米粒包裹后作用于骨質疏松動物模型，發現BPs毒性降低，骨質疏松治療療效提高。此外，BPs還可作為靶向載體與各種藥物分子連接形成骨組織的靶向藥物。如Sedghizadeh 等[9]將BPs結合環丙沙星形成偶聯物BV600022，體外研究發現通過調節pH值，BV600022緩慢釋放環丙沙星，起到持續抑菌效果，進一步利用假體骨髓炎大鼠模型發現單次小劑量(10 mg/kg)腹腔注射BV600022可達到與三次大劑量(30 mg/kg)注射環丙沙星相同的抑菌效果。

1.3 仿生蛋白類

1.3.1膠原結合區 (collagen binding domain,CBD):骨骼有機成分中I型膠原占了絕大部分，多種蛋白如甲狀旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)、基質細胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor 1α,SDF-1α)可通過與CBD結合，進而靶向骨骼。Ponnapakkam等[10]將PTH與CBD融合后單次腹腔內注射可顯著提高小鼠的骨密度。在大鼠股骨缺損模型中，CBD-SDF-1α與脫鈣骨基質支架結合植入缺損部位3 d，發現CBD-SDF-1α可募集C-kit和CD34陽性的內源性干細胞歸巢，顯著促進骨重塑[11]。

1.3.2小肽類:骨形成表面覆蓋成骨細胞以低晶體化的磷灰石為主，而骨吸收表面覆蓋破骨細胞以高晶體化的磷灰石為主[12]。牙本質磷蛋白是牙本質胞外基質中的一種主要非膠原蛋白，在牙齒發育過程啟動牙本質礦化和調節HA晶體生長速度中起重要作用，根據牙本質磷蛋白序列合成系列對鈣磷有較高親和力的小于25個氨基酸的肽，以多次重復三肽Asp-Ser-Ser(DSS)n為特征，與HA 的親和力隨(DSS)n重復次數成正相關[13]。進一步研究發現(DSS)6[14]特異與低晶體化的磷灰石結合從而靶向于骨形成表面。根據與HA可能結合位點處重復氨基酸序列(Asp or Glu)，合成與HA特異結合的非膠原蛋白(Asp)6[15]和(Asp)8[16]，用FITC作標記(Asp)6，大鼠靜脈注射(Asp)6-FITC后24 h取材，發現骨骼和牙齒均有熒光標記，而軟組織中無熒光標記，且血液中(Asp)6-FITC的半衰期由FITC的1 h延長到14 d。進一步研究發現(Asp)6和(Asp)8小肽特異與高晶體化的磷灰石結合從而靶向于骨吸收表面。

1.4 放射性藥物類

對于廣泛性腫瘤骨轉移出現的嚴重骨疼痛，放射性核素導向治療是近年來發展較快、療效較好的一種手段。如Strontium、Lanthanides 等親骨性放射性核素，由于與鈣類似的物理及化學特性，吸收后優先沉積于骨組織，并參與骨礦物質的代謝過程[17]。89SrCl2是FDA批準的第一個緩解骨轉移的放射性藥物，Strontium模擬鈣聚集在轉移部位，誘導礦化過程中骨細胞周圍胞外基質的聚集，提高成骨細胞活性及骨形成能力[18]。

2 靶向細胞

由于藥物無法分辨骨組織里的不同細胞，在治療過程中，靶向骨組織的藥物遞送將作用于所有細胞。因此，迫切需要更為精確與安全的靶向細胞的遞送系統。

2.1 靶向成骨細胞

核酸適配子是一類廣泛應用于藥物靶向遞送的單鏈寡核苷酸。2015年，Liang等[19]利用指數富集的配基系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)，以大鼠原代成骨細胞和人原代成骨細胞為靶標，大鼠肝細胞系BRL-3 A和PBMCs為消減靶子，成功篩選到靶向成骨細胞的核酸適配子CH6，結合脂質體納米粒包被Plekho1基因(成骨基因pleckstrin同源性家族O成員1)的siRNA，體外實驗發現CH6-LNPs-siRNA促使成骨細胞通過巨胞飲選擇性攝取Plekho1 siRNA。在健康與卵巢切除大鼠骨質疏松模型中，CH6可加強成骨細胞特異性的Plekho1基因沉默，促進骨形成及改善骨微結構，最終實現卵巢切除大鼠的骨量增加及骨骼機械性能恢復。

多肽由于空間結構簡單，分子量小，特異性高，滲透力強，且不易被酶類識別和降解，免疫原性低等特點，已被廣泛應用于藥物靶向遞送。Sun等[20]利用噬菌體展示技術，以小鼠成骨細胞系MC3T3-E1和人成骨細胞系hFOB1.19為靶標，篩選到特異靶向小鼠和人成骨細胞的多肽Ser-Asp-Ser-Ser-Asp (SDSSD)，通過親和色譜法和細胞結合實驗，進一步發現SDSSD多肽與成骨細胞特異因子2有較高親和力，結合聚氨酯 (Polyurethane,PU) 納米膠束包被anti-miR-214，建立靶向成骨細胞的核酸遞送系統，發現SDSSD-PU將anti-miR-214特異性遞送至骨形成面的成骨細胞，進而促進骨形成，改善骨骼力學性能。

2.2 靶向破骨細胞

破骨細胞表面的粘附分子整合素αVβ3，通過精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列在破骨細胞黏附至骨基質及骨吸收活性發揮中起重要作用。整合素αVβ3能激活巨噬細胞依賴的炎癥反應，促進破骨細胞的發育、遷移，骨吸收及炎癥形成。MEDI-522(又名Vitaxin)是一種與αVβ3亞基特異結合的人源性單克隆抗體，在風濕性關節炎動物模型中，發現Vitaxin能阻止整合素αVβ3與其各種配體如骨橋蛋白和玻連蛋白的結合，抑制破骨細胞的發育進而阻止后續炎癥形成及骨吸收作用[21]。

miRNA在調節骨穩態中起重要作用。老年女性骨折及卵巢切除小鼠的骨形成減少與破骨細胞miR-214-3p增高導致的血清外泌體miR-214-3p增高直接相關，miR-214-3p通過結合成骨轉化因子抑制成骨細胞的活性和基質礦化。使用D-Asp8將miR-214-3p 拮抗劑靶向破骨細胞可抑制其miR-214-3p的表達，繼而促進卵巢切除衰老小鼠骨形成[22]。

2.3 靶向骨細胞

早期腫瘤骨轉移過程中，乳腺癌細胞通過分泌甲狀旁腺激素相關蛋白刺激骨細胞釋放核轉錄因子受體、骨保護素和硬骨素，進而調控破骨細胞生成和加速腫瘤骨轉移。Qiao等[23]研究發現唑來膦酸對早期腫瘤骨轉移部位骨細胞有較高親和力，唑來膦酸和白花丹素可協同作用緩解腫瘤轉移引起的骨破壞。唑來膦酸和白花丹素結構模擬三磷酸腺甘酸競爭抑制成骨細胞環磷腺苷效應元件結合蛋白、細胞外調節蛋白激酶和氨基末端激酶的磷酸化，從而抑制轉移微環境內骨細胞分泌核轉錄因子受體和硬骨素[24]。進一步研究建立了pH響應的靶向骨細胞藥物遞送系統，以唑來膦酸為靶頭并載藥白花丹素的納米顆粒PUCZP，研究發現PUCZP靶向骨細胞，pH響應釋放白花丹素，抑制成骨細胞誘導破骨細胞生成及骨溶解，從而抑制腫瘤骨轉移[25]。

2.4 靶向干細胞

Iwagawa等[26]通過消減SELEX技術，以小鼠胚胎干細胞系為靶標，小鼠皮下結締組織細胞系A9為消減靶子，L1-65為競爭適配體，篩選到靶向小鼠胚胎干細胞的核酸適配子，通過MPBind從已有適配子序列中分析預測得到8種和人誘導多能干細胞特異結合的核酸序列[27]，選擇親和力最高的序列Apt19進行系列平截，得到特異靶向誘導多能干細胞的核酸適配子Apt19S[28]。在骨軟骨缺損模型中，Apt19S結合雙層支架可募集內源性間充質干細胞從骨髓到缺損部位， 分別促進間充質干細胞向軟骨細胞和成骨細胞分化，顯著提高缺損修復能力[29]。

間充質干細胞表達多種整合素亞基，如α1、2、3、4、6、11、CD51(αV)和CD29(β1)，成骨細胞表達整合素β1亞基，間充質干細胞過表達整合素α4亞基可促進干細胞的募集及向成骨細胞分化[30]。Yao等[31]發現，小分子多肽模擬物LLP2A可有效結合間充質干細胞表面整合素受體α4β1，LLP2A與阿倫膦酸鈉 (Alendros,Ale)結合制成肽模擬復合物LLP2A-Ale，可促進間充質干細胞遷移和成骨分化能力。在異種移植和具免疫活性小鼠中，單次靜脈注射LLP2A-Ale可顯著促進股骨和脊柱骨小梁的形成。此外，LLP2A-Ale還可防止雌激素缺乏引起的小梁骨丟失，進而提高骨密度和骨量。

3 討論與展望

綜上所述，新型靶向細胞特異性遞送系統，理論上可以將具有治療效應的藥物通過精準識別來實現細胞特異性遞送，從而推動靶向藥物的研發。骨性關節炎為關節慢性進行性病變，是以關節軟骨退化、變性和繼發的軟骨增生、骨化為主要病理變化的一種疾病，由于關節軟骨內無血管、神經及淋巴管，關節軟骨的自我修復能力極差。目前國內外對骨性關節炎的研究較多，但仍缺乏能有效安全防治骨性關節炎的藥物。

IL-17/IL-17RA介導炎癥因子IL-1、6、8的信號轉導，調控蛋白水解酶活性，促進基質降解，參與關節炎的發生。Chen等[32]通過SELEX技術，以NIH3T3細胞系為對照，IL-17RA-缺陷的NIH3T3細胞系為靶標，篩選到特異結合IL-17RA的核酸適配子RA10-6，在大鼠內側半月板不穩定手術誘導的關節炎模型中，關節腔注射適配子RA10-6可有效緩解關節炎引起的滑膜增厚表型，這是建立在已知靶分子基礎上的靶向細胞治療。目前仍未見直接靶向軟骨細胞的相關報道，因此，篩選早期靶向關節炎樣細胞的適配子，有助于防治骨性關節炎藥物的研發。