腸球菌對利奈唑胺耐藥機制研究進展

李 培， 林東昉

腸球菌系革蘭陽性球菌，廣泛存在于人和動物的消化道及女性生殖道中，是重要的條件致病菌，多見于醫院感染。由于細菌固有耐藥和獲得性耐藥的雙重特性，以及各類抗生素廣泛應用于臨床造成的高選擇性壓力，導致多重耐藥（multiple drug resistance，MDR）腸球菌增多，甚至出現耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistant enterococci，VRE）。2000年利奈唑胺上市，是首個應用于臨床的唑烷酮類抗菌藥物，用于治療MDR革蘭陽性菌感染，尤其是治療VRE和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）。近年來，利奈唑胺耐藥腸球菌的數量呈逐年增多趨勢，同時新耐藥機制的發現也使此藥在臨床上的使用遇到了挑戰。

1 腸球菌的耐藥性

腸球菌細胞壁堅厚，對很多抗生素呈固有耐藥。例如通過產生低親和力的青霉素結合蛋白（PBP）[1]。由于細胞壁的作用導致藥物滲透障礙和產生氨基糖苷類抗生素低水平耐藥。此外，腸球菌可以通過靶位改變、產生各種酶類（如鈍化酶、水解酶等）、獲得可轉移的耐藥基因、主動外排等機制對各類抗生素如β內酰胺類、糖肽類、氨基糖苷類（高水平）、氟喹諾酮類、大環內酯類、磷霉素類等耐藥。在對VRE的研究過程中，現已發現vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM、vanN等耐藥基因亞型，此類基因通過影響細胞壁對糖肽類抗生素的親和力而介導耐藥。腸球菌對新型抗菌藥物利奈唑胺的耐藥機制如23S rRNA突變、cfr基因等將于下文進行描述。

2 中國腸球菌耐藥性變遷

耐藥菌株的出現與抗生素的使用緊密相關，對腸球菌耐藥率的統計和研究能更全面地指導臨床用藥。

2005－2016年中國CHINET細菌耐藥性監測結果顯示，國內革蘭陽性菌株中腸球菌分離率在30%上下波動，2016年為29.3%[2-13]。其中最主要的兩種腸球菌，糞腸球菌和屎腸球菌對慶大霉素、氯霉素、磷霉素等耐藥率有下降趨勢，糞腸球菌對上述抗生素耐藥率分別從61.4%、43.5%、15.7%下降至33.0%、23.4%、3.0%，屎腸球菌則分別從81.9%、8.5%、31.2%下降至48.0%、5.8%、19.9%。對左氧氟沙星的耐藥率比較穩定，兩種菌分別在25%和85%左右。對紅霉素、利福平等的耐藥率居高不下，均在50%以上。對萬古霉素、替考拉寧、利奈唑胺等耐藥率目前處于低水平，均低于4%。備受關注的VRE，11年來，其耐藥率目前也僅為0.4%（糞腸球菌）和1.9%（屎腸球菌）。參考上述數據，雖然腸球菌對利奈唑胺耐藥率絕對值不是很高，但在最新2016年監測報告中糞腸球菌對利奈唑胺耐藥率已有1.2%；屎腸球菌為0.2%。這些近年出現的利奈唑胺耐藥菌株不容忽視，了解利奈唑胺的作用機制更有助于解決目前臨床應用所遇到的問題。

3 利奈唑胺的作用機制與抗菌活性

利奈唑胺是一種細菌蛋白質合成抑制劑。它是通過結合核糖體肽基轉移酶活性中心（peptidyl transferase center，PTC）的A位點發揮作用。A位點位于核糖體催化功能核心23S rRNA的V區[14]。利奈唑胺與50S核糖體亞基的結合，使3'末端氨基酰-tRNA（fMet-tRNA）受到干擾而無法進行肽酰轉移，抑制蛋白質合成的初始階段，但不影響翻譯起始tRNA的形成、延伸與終止階段[15]，這與以往抗菌藥物抑制蛋白合成的作用方式不同。獨特的作用特點使利奈唑胺與其他抗菌藥物不容易發生交叉耐藥，在體外也不容易誘導細菌產生耐藥。

利奈唑胺對MRSA和VRE等革蘭陽性菌，在體外和體內均具有抑菌活性[16]，對肺炎鏈球菌等鏈球菌屬具有殺菌作用，對革蘭陰性菌幾乎沒有抗菌活性，但對厭氧菌有一定活性[17]。在健康人體內，利奈唑胺口服后平均絕對生物利用度可達100%。穩態分布容積與人體含水總量相當，滲透性強，半衰期長，其代謝產物主要通過尿液排泄[18]。良好的藥動學、藥效學特性也使利奈唑胺在臨床上用于革蘭陽性菌感染治療頗有優勢。

4 腸球菌耐利奈唑胺的耐藥機制

根據2017年美國臨床和實驗室標準化協會指南（CLSI），當利奈唑胺對腸球菌MIC≥8 mg/L時，定義為耐藥；4 mg/L，為中介；≤2 mg/L，為敏感。根據已知的耐藥機制，可以分為兩大類。

4.1 非轉移性耐藥

4.1.1 23S rRNA V區突變 此突變是目前已知最主要的耐藥機制，且糞腸球菌比屎腸球菌更容易被誘導突變[19]。突變方式為點突變，最常見的突變位置為G2576U[20]。有研究表明，經過誘導后V區2576位核苷酸發生突變，糞腸球菌和屎腸球菌的MIC在此位點突變后均有不同程度的升高，分別上升至8～128 mg/L和8～64 mg/L[21]，與突變23S rRNA拷貝數呈正相關。另外在耐藥腸球菌株中還發現有C2192T、C2461T、U2500C、A2503G、G2505A等位點的突變。

4.1.2 核糖體蛋白L3、L4或L22突變rplC、rplD、rplV基因分別編碼核糖體蛋白L3、L4、L22。在金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革蘭陽性菌株中發現這些核糖體蛋白的突變可導致對利奈唑胺由敏感變為耐藥[22]。在腸球菌中此突變所致的利奈唑胺耐藥很少見，但最近有研究發現1株耐利奈唑胺屎腸球菌中存在核糖體蛋白L4上Asn130Lys的突變，同時此株菌也含有另外一個利奈唑胺耐藥基因optrA[23]，是否L4突變可影響腸球菌的耐藥性值得進一步探究。

4.2 轉移性耐藥

此類耐藥通過外源性質粒介導。

4.2.1 氯霉素-氟甲砜霉素耐藥（cfr）基因

4.2.1.1cfr基因[24]cfr基因屬于S-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶蛋白質超家族，在自然界中廣泛存在，是多重耐藥基因。它通過編碼cfr甲基轉移酶，催化細菌核糖體23S rRNA肽酰轉移酶區域A2503位C8甲基化[25]產生耐藥。該基因可導致細菌對氯霉素類、林可酰胺類、唑烷酮類等抗菌藥物耐藥。介導氯霉素類和林可酰胺類抗生素耐藥機制中還伴有核苷酸C2498位甲基化的抑制作用。目前攜帶該耐藥基因的質粒多見于動物葡萄球菌、腸球菌分離株[26]。

4.2.1.2cfr(B)分型 2015年美國首次報道了從臨床屎腸球菌分離株中發現的新cfr基因型——cfr(B)基因，和先前已知的葡萄球菌和非屎腸球菌類腸球菌cfr編碼的氨基酸序列相比較，它們的同源性僅有74.9%。該基因是通過整合在轉座子Tn6218上在屎腸球菌以及艱難梭菌間傳播，有可能造成大范圍的傳播[27]。但是關于含有此基因亞型腸球菌屬的耐藥水平需進一步確認。

4.2.2optrA基因 2015年報道了新的可導致對利奈唑胺耐藥的基因——optrA基因，該基因具有可轉移性，可通過質粒傳播[28]。optrA基因編碼ABC家族F亞家族蛋白。ABC超家族可分為3類，前兩類外向轉運子及內向轉運子參與轉運，第三類則現mRNA的翻譯和DNA的修復有關[29]。經典的ABC超家族主要由跨膜區（transmembrane domain，TMD）和ATP結合域（nucleotide-binding domain，NBD）組成。而ABC-F家族組成缺乏跨膜區，僅有ATP結合域。以往關于該家族導致耐藥的機制有兩種假說，一是經典外排效應，通過ATP水解釋放能量，細胞內藥物通過跨膜區被轉運出去。二是核糖體保護機制，通過競爭性地抑制藥物與核糖體結合，從而降低胞內的藥物濃度。2016年有研究通過對該家族基因vga(A)、lsa(A)進行轉錄翻譯實驗及核糖體藥物結合實驗，發現該家族導致耐藥的機制更傾向于后者[30]。此外近些年又不斷發現了一些optrA基因變異型，其中EYDD型（發生三處氨基酸改變：Lys3Glu、Asn12Tyr、Tyr176Asp）可使金黃色葡萄球菌和糞腸球菌的利奈唑胺MIC升高2～8倍[31]。但利奈唑胺MIC中介及敏感菌株中也存在此基因，其耐藥性的發生可能和其他機制有協同作用，或者有某種機制導致該基因低表達等，具體機制如何有待深入研究。

在研究耐藥機制的同時，有實驗通過比較利奈唑胺敏感與耐藥/中介腸球菌，發現耐藥者具有更厚的生物膜。而且通過透射電子顯微鏡觀察，利奈唑胺耐藥或中介的腸球菌細胞壁往往比敏感者更厚[32]。生物膜是否參與耐藥形成有待進一步探究。

腸球菌是重要的條件致病菌，耐藥機制復雜。近些年來，利奈唑胺作為有效的抗菌藥物在臨床得到廣泛使用，因為耐藥菌株不斷增多以及新型耐藥菌株的出現，使得臨床對腸球菌感染的預防與治療變得更加棘手。對利奈唑胺等新型藥物耐藥的臨床分離株過快出現，也提示需要嚴格控制使用此類藥物。此外，新耐藥機制的發現也使得未來利奈唑胺應用于臨床治療革蘭陽性球菌感染受到挑戰，且不排除其他新的耐藥機制存在。在加強細菌耐藥監測的同時也應開展相關耐藥新機制的研究。

[1] OFFERMANNS S， ROSENTHAL W. Penicillin binding protein[M]. Encyclopedia Mol Pharmacol， 2008 ：936.

[2] 胡付品， 朱德妹， 汪復， 等. 2015年 CHINET 細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2016，16（6）：685-694.

[3] 胡付品， 朱德妹， 汪復， 等. 2014年CHINET中國細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2015，15（5）：401-410.

[4] 胡付品， 朱德妹， 汪復， 等. 2013年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2014，14（5）：365-374.

[5] 汪復， 朱德妹， 胡付品， 等. 2012年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2013，13（5）：321-330.

[6] 胡付品， 朱德妹， 汪復， 等. 2011年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2012，12（5）：321-329.

[7] 朱德妹， 汪復， 胡付品， 等. 2010年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2011，11（5）：321-329.

[8] 汪復， 朱德妹， 胡付品， 等. 2009年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2010，10（5）：325-334.

[9] 汪復， 朱德妹， 胡付品， 等. 2008年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2009，9（5）：321-329.

[10] 汪復， 朱德妹， 胡付品， 等. 2007年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2008，8（5）：325-333.

[11] 汪復. 2006年中國CHINET細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2008，8（1）：1-9.

[12] 汪復. 2005中國CHINET細菌耐藥性監測結果[J]. 中國感染與化療雜志， 2006，6（5）：289-295.

[13] 胡付品， 朱德妹， 汪復， 等. 2016年CHINET中國細菌耐藥性監測[J]. 中國感染與化療雜志， 2017，17（5）：481-491.

[14] KLOSS P， XIONG L， SHINABARGER DL， et al. Resistance mutations in 23 S rRNA identify the site of action of the protein synthesis inhibitor linezolid in the ribosomal peptidyl transferase center[J]. J Mol Biol， 1999，294（1）：93-101.

[15] LONG KS， VESTER B. Resistance to linezolid caused by modifications at its binding site on the ribosome[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2012，56（2）：603.

[16] SHINABARGER DL， MAROTTI KR， MURRAY RW， et al.Mechanism of action of oxazolidinones： effects of linezolid and eperezolid on translation reactions[J]. Antimicrob Agents Chemother， 1997，41（10）：2132-2136.

[17] HAMEL JC， STAPERT D， MOERMANN JK， et al. Linezolid，critical characteristics[J]. Infection， 2000，28（1）：60-64.

[18] MACGOWAN AP. Pharmacokinetic and pharmacodynamic profile of linezolid in healthy volunteers and patients with Grampositive infections[J]. J Antimicrob Chemother， 2003，51（Suppl 2）：i17-i25.

[19] PRYSTOWSKY J， SIDDIQUI F， CHOSAY J， et al. Resistance to linezolid： characterization of mutations in rRNA and comparison of their occurrences in vancomycin-resistant enterococci[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001，45（7）：2154.

[20] WILSON P， ANDREWS JA， CHARLESWORTH R， et al.Linezolid resistance in clinical isolates ofStaphylococcus aureus[J]. J Antimicrob Chemother， 2003，51（1）：186-188.

[21] 席瑞， 田素飛， 褚云卓， 等. 利奈唑胺體外誘導腸球菌耐藥及耐藥機制研究[J]. 中國感染與化療雜志， 2011，11（1）：22-26.

[22] LOCKE JB， HILGERS M， SHAW KJ. Mutations in ribosomal protein l3 are associated with oxazolidinone resistance in staphylococci of clinical origin[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2009，53（12）：5275-5278.

[23] TAMANG MD， MOON DC， KIM SR， et al. Detection of novel oxazolidinone and phenicol resistance gene optrA in enterococcal isolates from food animals and animal carcasses[J]. Veterinary Microbiol， 2017，201 ：252-256.

[24] DIAZ L， KIRATISIN P， MENDES RE， et al. Transferable plasmid-mediated resistance to linezolid due to cfr in a human clinical isolate ofEnterococcus faecalis[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2012，56（7）：3917-3922.

[25] ATKINSON GC， HANSEN LH， TENSON T， et al. Distinction between the Cfr methyltransferase conferring antibiotic resistance and the housekeeping RlmN methyltransferase[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2013，57（8）：4019-4026.

[26] LONG KS， POEHLSGAARD J， KEHRENBERG C， et al. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols， Lincosamides， Oxazolidinones， Pleuromutilins， and Streptogramin A Antibiotics[J]. Antimicrob Agents Chemother，2006，50（7）：2500-2505.

[27] DESHPANDE LM， ASHCRAFT DS， KAHN HP， et al.Detection of a new cfr-like gene， cfr（B）， inEnterococcus faeciumisolates recovered from human specimens in the United States as Part of the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2015，59（10）：6256-6261.

[28] WANG Y， LV Y， CAI J， et al. A novel gene， optrA， that confers transferable resistance to oxazolidinones and phenicols and its presence inEnterococcus faecalisandEnterococcusfaeciumof human and animal origin[J]. J Antimicrob Chemother， 2015，70（8）：2182-2190.

[29] DAVIDSON AL， DASSA E， ORELLE C， et al. Structure，function， and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems[J]. Microbiol Mol Biol Rev， 2008，72（2）：317-364.

[30] SHARKEY LK， EDWARDS TA， O NEILL AJ. ABC-F proteins mediate antibiotic resistance through ribosomal protection[J].MBio， 2016，7（2）：e01975.

[31] CUI L， WANG Y， LV Y， et al. Nationwide surveillance of novel oxazolidinone resistance gene optra inEnterococcusisolates in China from 2004 to 2014[J]. Antimicrob Agents Chemother，2016，60（12）：7490.

[32] CAI JC， HU YY， ZHANG R， et al. Linezolid-resistant clinical isolates of meticillin-resistant coagulase-negative staphylococci andEnterococcus faeciumfrom China[J]. J Med Microbiol，2012，61（11）：1568-1573.