輔助生殖技術對試管嬰兒活產率影響的研究進展

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(1.空軍工程大學校務部門診部，陜西 西安 710038；2.空軍軍醫大學第二附屬醫院婦產科生殖醫學中心，陜西 西安 710038)

自1978年世界上第一位試管嬰兒誕生以來，關于輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)其中一個重要問題是其相對較低的每周期活產率。根據2009年在歐洲人類生殖與胚胎協會(ESHRE)登記的50多萬名試管嬰兒的信息，通過自身新鮮胚胎移植的女性，包括體外受精(in vitro fertilization，IVF)和卵胞漿內單精子注射技術(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，其周期的活產率是22%，冷凍周期移植的活產率是15%，而通過贈卵移植的女性，新鮮周期和冷凍周期移植的活產率達到了30%[1]。這些指標明顯低于2009年由美國疾病控制中心(CDC)公布的相關數據。美國CDC公布的數據顯示，自身新鮮卵子或胚胎移植的活產率是37%，冷凍周期是30%，而通過贈卵進行新鮮周期和冷凍周期移植的活產率分別是55%和34%。ESHRE與美國CDC兩者公布數據差異的一部分原因可能是由于美國的ART臨床機構公布ART結局時存在偏差[2]。但需要強調的是，這些數據主要是用作參考和了解大規模經ART助孕人群的治療情況，而并非用來進行系統分析和統計。

盡管近些年來ART周期移植的活產率有小幅度增高，但ART的成功率仍沒有達到令人滿意的程度。近十幾年許多研究者和研究機構投入了大量人力、物力、財力用于研究超數排卵藥物治療，配子獲取和成熟技術，助孕技術，配子、胚胎的體外培養和冷凍保存，胚胎的優選，胚胎移植的質量控制，黃體期支持治療；卵巢過度刺激綜合征的預防及子宮內膜的移植條件等其他因素[3]。從這些巨大的投入來看，ART技術本身就可能會影響周期活產率。

目前有許多文獻報道了ART對印記紊亂、印記基因甲基化水平及ART子代健康的潛在影響[4-6]，但是關于ART引起的表觀遺傳修飾改變對活產率的影響卻鮮有報道。ART治療過程中的各項體外操作和體外培養是在胚胎發生全基因表觀遺傳重編程這一特殊發育時期進行的[7]。因此這些人為操作可能會導致胚胎的表觀遺傳修飾紊亂，進而影響移植前胚胎的發育和ART周期活產率。現就ART治療過程中的各項體外操作和體外培養對周期活產率影響的相關研究進展進行綜述。

1卵巢刺激

目前認為，卵細胞在生長階段將會進行表觀遺傳標記，這一過程發生在卵細胞減數分裂完成和排卵之前[8]，這提示超數排卵過程可能改變卵細胞的表觀遺傳修飾，進而影響后續的ART活產率。超數排卵可能使卵細胞發育速度過快，卵細胞不夠成熟或者發生選擇性閉鎖，這種負面效果會影響卵細胞的質量，并且可能會干擾卵細胞在發育過程中的甲基化印記和移植前胚胎甲基化印記的維持。在對小鼠的研究中發現，超數排卵對母源印記表達基因(H19)和父源印記表達基因(Snrpn，Peg3，Kcnq1ot1)的甲基化水平的影響存在劑量效應關系[9]。此外，外源性激素藥物的應用可能改變子宮環境，影響子宮內膜的成熟[10]和參與正常子宮內膜容受性基因的轉錄活性[11]，因此會干擾基因印記的維持。

最近一篇文獻綜述認為，與女性卵細胞基因獲取印記相比，卵巢刺激對基因印記維持的不良效應更加顯著[12]。但是，這項研究存在一定的缺陷，這些卵細胞均來自IVF或ICSI周期中質量較差的卵細胞，這些卵細胞對人絨毛膜促性腺激素(hCG)的促進卵子成熟作用反應不佳，因此該文獻的結論可信度不高。

2配子低溫貯存

卵子和精子的低溫貯存均可能會影響受精之前的配子和移植前胚胎的基因印記。上述提到，卵細胞減數分裂完成和排卵之前，卵細胞在生長階段將會發生表觀遺傳標記。同樣地，竇狀小卵泡的全基因組轉錄活性沉默是發生在減數分裂完成之前[12-13]。同時，成熟的卵泡儲存了大量的mRNA，這些mRNA攜帶了許多在減數分裂期、受精時和移植前發育階段所需蛋白的編碼信息，包括卵細胞特異性DNA甲基化轉移酶(DNMT1o)，這種酶在早期發育階段起著維持基因甲基化標記的作用[14]。因此，卵細胞中儲存的信息對卵子成熟、受精和移植前胚胎發育階段，具有表觀調控的作用。

2.1卵子冷凍

與慢速冷凍卵子相比，卵子玻璃化冷凍解凍后更容易存活，具有較高的胚胎發育潛能。另外，經過玻璃化冷凍的卵子，其受精率、移植率、妊娠率和活產率均接近于新鮮的卵子(針對的主要是年齡不超過34歲的女性)[15-16]。但另有一篇設計良好的配對隨機對照試驗研究認為，玻璃化冷凍卵子行ICSI時的受精率較差，并且受精成功的胚胎發育至囊胚速度較慢，但是關于非整倍性囊胚的發生率和繼續妊娠率，玻璃化冷凍卵子組與非玻璃化對照組之間相近[17]。

關于玻璃化冷凍尚未成熟的人卵細胞的一些研究表明，與卵子體外成熟相比，玻璃化冷凍并沒有導致印記甲基化紊亂的風險增加[18]。同時研究發現，可編碼8個與胚胎發育密切相關的蛋白質轉錄本，它們在玻璃化冷凍后解凍的卵子與在人減數分裂中期(MⅡ)的新鮮卵子中含量相近[19]。但也有研究認為，人MⅡ期卵子經玻璃化冷凍和慢速冷凍后解凍均減少卵細胞中儲存的轉錄本水平[20]。

2.2精子冷凍

相反，精子印記標記是一個逐步重建的過程，從胎兒發育時期的原始生殖細胞開始，到出生后精子減數分裂仍繼續進行著[21]。男性精子的甲基化印記在A型精原細胞就已經建立，并通過精子生成過程中DNMTs的mRNA表達和蛋白合成來維持其甲基化印記。精細胞基因組某些區域由組蛋白而非魚精蛋白包被，使得精子基因組結構不至過于緊密，這有利于受精前基因進行轉錄。另外，精子的核組蛋白成分可以豐富有活性的逆轉座子，這種逆轉座子維持精子基因組某些區域的轉錄活化狀態。精原細胞也具有翻譯活性，可以利用線粒體酶翻譯來自細胞核和線粒體的轉錄本[17]。

目前尚缺乏比較新鮮精子、慢速冷凍精子及玻璃化冷凍精子之間的ART活產率的臨床隨機對照試驗。但是已了解到，慢速冷凍人類精子可以造成精子DNA碎片化，但精子慢速冷凍沒有影響精子一些母源和父源印記基因、重復序列，及與精子生成和男性不孕相關的特異性基因的甲基化模式[22]。相反，玻璃化冷凍精子和低溫貯存精子可造成精子DNA損傷及一些男性特異性基因和印記基因mRNAs的表達[23]。

3卵子體外成熟

正常排卵的女性[24]和多囊卵巢的女性[25]，當其卵子經過體外非刺激性成熟培養后，與IVF或ICSI周期的標準超數排卵相比，均會表現出較低的胚胎移植率和臨床妊娠率。多囊卵巢的女性卵子經過體外成熟培養后，也會表現出較低的活產率[25]。卵子體外成熟引起的不良影響，可能與體外成熟培養期間基因印記標記紊亂、基因轉錄異常和蛋白合成異常有一定的聯系。研究發現，與體內成熟的卵子相比，體外成熟培養的MⅡ期卵子儲存的基因轉錄本發生了改變，而這些轉錄本與減數分裂、細胞周期調控及細胞蛋白代謝過程具有相關性[26]。此外，一項關于恒河猴的研究認為，未經hCG處理的體外成熟培養的卵子與經過hCG處理的體內成熟卵子相比，兩組卵細胞中的轉錄本水平僅有微小的差異性[27]。

4卵泡漿內單精子注射技術

盡管在一些男性和不明原因的不孕夫婦中，ICSI相對于IVF，可以增加受孕率并降低受精失敗的風險[28]。但是2010年美國CDC公布的關于ART總結報道中，認為從2001至2010年期間，與無ICSI的ART周期相比，ICSI周期的移植活產率一直表現為較低，在新鮮贈卵周期中，ICSI周期活產率是45%～55%，無ICSI的ART周期活產率是49%～57%，而在新鮮自身卵細胞移植周期中，ICSI周期活產率是32%～36%，無ICSI的ART周期活產率是35%～38%[2]。無ICSI的ART周期和ICSI周期這兩組活產率的微小差別，可能的原因是用于ICSI的精子是源自精液異常的男性患者，這些精子基因或表觀遺傳修飾存在異常。這種異常的精子作用于MII期卵子后可能會導致形成的胚胎表觀遺傳修飾缺陷，從而降低了ICSI周期的活產率。但是關于ICSI本身是否會引起胚胎表觀遺傳發生改變，有關這方面的研究結果尚存在較大的爭議。

有文獻報道，ICSI來源的胚胎和IVF來源的胚胎，兩者在形態評分較低的情況下，前者更容易表現出組蛋白3-賴氨酸-9(H3K9)低甲基化水平[29]。也有研究認為，ICSI來源的和IVF來源的人類胚胎在全基因組的甲基化水平、染色質結構和印記基因的甲基化，兩者無顯著性差異[30]。關于小鼠的研究也認為，ICSI來源的和IVF來源的囊胚，兩者全基因組表達情況明顯不同[31]。另一研究發現，ICSI來源的和IVF來源的小鼠胚胎，兩者在囊胚階段出現的轉錄組差異在新生兒期仍存在，到了8周后這種差異才消失，然而，還沒有證據顯示這種差異會通過自然交配遺傳給下一代[32]。

5胚胎體外培養系統

一篇隨機對照試驗的系統綜述仍沒有確定出哪種胚胎培養基可以保證得到最好的ART臨床結局[33]。而且在被納入分析的研究中發現，在不同的培養基質之間，其相應的臨床妊娠率存在超過5%的差異，這也說明了選擇良好的培養基對于IVF或ICSI周期成功率是有必要的。在移植前階段，人類囊胚處于不適宜的培養環境中，其全基因組表達模式會受到干擾[34]。但是在對小鼠的實驗中，研究者發現小鼠胚胎盡管經過不適宜的培養基培養，但是其產生的子代仍是健康的，因此認為胚胎培養基可能不會對所有胚胎的全基因組表達產生干擾[35]。

6胚胎低溫貯存

相關文獻報道，與新鮮胚胎移植相比，凍融胚胎移植的臨床妊娠率和繼續妊娠率均較高，并可以降低與多胎妊娠無關的胎兒期和圍產期發病率，其原因可能是凍融胚胎周期的胚胎與子宮內膜的同步性較好[36-37]。但是，胚胎低溫貯存對ART活產率也有負面影響。2011年美國CDC公布的數據顯示，凍融胚胎的周期活產率是35.7%(2 500/7 143)，新鮮胚胎的周期活產率是54.8%(5 352/9 767)[2]。但是美國CDC的數據沒有詳細說明胚胎低溫貯存的方式及胚胎是何時冷凍和移植的，而這一點很重要，原因是相對于卵裂期胚胎和慢速冷凍的胚胎，囊胚和玻璃化冷凍胚胎的妊娠率更高。相關數據表明，胚胎低溫貯存可以改變DNA甲基化和基因表達，尤其是受精卵的慢速冷凍，明顯可以改變移植前與發育相關基因的表達[38]。

7胚胎活檢

來自1997至2008年的歐洲數據顯示，胚胎移植前基因診斷(PGD)和移植前基因篩選(PGS)周期的移植率、臨床妊娠率、流產率及活產率與單純ICSI周期相接近[39-40]。近年的一些前瞻性研究報道，與僅通過形態學評分選擇的囊胚相比，經過活檢的整倍性囊胚選擇性移植后，能夠提高臨床移植率、持續移植率、臨床妊娠率和活產率[41-43]。但是胚胎活檢這一過程是否安全，目前還沒有定論，原因是這些經過PGD或PGS的胚胎本身就存在本質上的缺陷。

目前也有針對胚胎活檢技術本身是否對人類胚胎和胎兒發育產生影響的相關研究，結果認為，胚胎活檢操作和一些物理化學干涉，不論多輕微，均有可能影響子代短期或長時程健康。例如，在人類D2和D3的胚胎中，對第一和第二極體進行激光活檢與未行活檢的胚胎相比，前者胚胎更容易出現發育遲滯和形態學缺陷[44]。與未行活檢胚胎或僅移除1個分裂球細胞相比，從8細胞階段移除2個分裂球細胞會降低囊胚形成率、生化妊娠率及活產率[45]。另外，當胚胎發育至6～8個細胞階段時，移除其1個分裂球細胞，對該胚胎進行時間追蹤分析發現，這一活檢過程并未影響胚胎的卵裂率，但是延長了胚胎分裂的時間。因此，經過活檢的胚胎在發育上出現延遲，并開始從透明帶脫離下來，而未活檢的胚胎以較小的形態在透明帶中逐漸孵育出來[46](因為活檢過程破壞了透明帶，所以活檢的胚胎無需同未活檢胚胎要經歷透明帶孵出這一過程)。這種胚胎發育階段和透明帶脫離過程的不同步，可能導致D3時移除1個分裂球細胞進行活檢的胚胎的臨床移植率和持續移植率下降[47]。

綜上所述，ART治療過程中的各項體外操作和體外培養均對ART周期活產率產生了一定的影響，而且這種影響可能是由于ART治療過程引起配子或胚胎的表觀遺傳修飾，使得配子或胚胎的基因表達出現異常，從而影響ART周期活產率。