麥類作物花藥離體培養特性遺傳控制研究進展

趙林姝，劉錄祥

(中國農業科學院作物科學研究所/國家農作物航天誘變技術改良中心/作物分子育種國家工程實驗室，北京 100081)

花藥離體培養技術在品種選育、DH遺傳群體構建、突變體創制及轉基因研究中發揮著重要作用。研究表明，花藥離體培養胚狀體和愈傷誘導、綠苗及白苗再生均是可遺傳的數量性狀，同時也受供體植株的生長環境、生理狀態、花藥預處理和離體培養條件等多種因素影響[1-3]。基因型依賴性和白苗再生是目前制約花藥離體培養技術潛力充分發揮的主要因素[4-5]，解析這些限制性因素產生的原因是解決問題的關鍵。自20世紀70年代麥類作物花藥離體培養體系建立后，各國學者相繼利用非整倍體、代換系、易位系、雙列雜交、細胞學及生理生化的方法開展了愈傷誘導、綠苗及白苗再生的遺傳控制研究，初步揭示了控制愈傷誘導及花粉植株再生相關基因所在的染色體。隨著分子生物學技術的發展，分子標記技術、基因克隆、轉錄組學及蛋白組學方法逐漸應用于花藥離體培養各階段的遺傳研究，并取得一定進展。本文對國內外學者在麥類作物花藥離體培養特性遺傳控制解析方面的研究進行了綜述，以期為克服花藥離體培養基因型障礙等問題及提高花藥離體培養效率提供一定參考。

1 花藥離體培養過程中預處理效應的遺傳控制

低溫、高溫、饑餓及滲透壓等壓力因素預處理均能使離體培養花藥中的小孢子由配子體發育途徑轉變為孢子體發育途徑，促使胚性小孢子重復分裂最終誘導產生單倍體胚狀體和愈傷進而再生花粉植株[1]。研究發現，這些壓力因素預處理誘導胚狀體發育的效應相似，表明這些預處理的機制是非特異性的。

1.1 低溫預處理

低溫預處理是各種作物花藥離體培養中普遍采用的預處理方式[5]。Iwona等[1]比較未經預處理及4 ℃低溫預處理3周后小黑麥花藥中的脫落酸(ABA)含量，發現低溫預處理能使花藥中ABA含量顯著增加，進而增強離體培養初期小孢子抗氧化系統的活性，維持離體培養過程中小孢子的活力。低溫預處理能顯著增加過氧化氫的積累，維持抗氧化酶的活性能力，同時也保護細胞免受活性氧(ROS)的毒性影響，抗氧化酶的作用是高活性的非酶抗氧化劑無法取代的；低溫產生的信號啟動小孢子發育途徑的轉變，是獲得高效胚狀體形成能力的重要因素[6]。Krzewska等[7]對4個具有不同再生能力的小黑麥DH系的花藥進行低溫處理，分析處理前后花藥的蛋白組學，發現低溫處理能增加抗氧化應激的細胞防御蛋白(如抗壞血酸過氧化物酶)、細胞伴侶(如HSP70)、蛋白質生物合成相關酶及細胞分裂相關蛋白的積累，從而引發小孢子的胚胎發育。

1.2 甘露醇預處理

甘露醇預處理對胚狀體誘導及綠苗再生具有較好的效果[8]。Maraschin等[9]利用cDNA宏陣列的方法研究了甘露醇預處理大麥花藥后啟動小孢子由配子體發育途徑轉向孢子體發育路徑的分子機制，發現正常發育的單核及雙核小孢子中表達的細胞分裂相關基因以及參與脂類生物合成、淀粉合成及能量合成的轉錄產物，在經甘露醇處理4 d的小孢子中均表達下調，說明甘露醇預處理能阻礙花粉發育相關基因的表達；糖和淀粉水解、蛋白水解、應激反應、程序性細胞死亡抑制和信號轉導相關產物的上調表達是甘露醇預處理誘導胚狀體發育的標志，分析顯示，小孢子離體培養胚狀體發育的潛力和編碼乙醇脫氫酶3、金屬蛋白酶基因、半胱氨酸蛋白酶1前體、天冬氨酸蛋白酶及26S蛋白酶體調節亞單位基因的誘導有關 。Munoz-Amatriain等[10]利用22K大麥芯片對甘露醇預處理前后花藥的轉錄組學進行研究，發現了2 673個差異表達基因，其中887個基因上調表達，1 786個基因下調表達；轉錄因子分析顯示，多數下調表達的轉錄因子與生長和發育相關，上調表達的轉錄因子多與非生物及生物逆境有關，多數細胞周期相關基因沒有變化。

1.3 硫酸銅預處理

硫酸銅是小孢子離體發育的必須元素，硫酸銅的缺失會使葉綠素含量降低[11]。Jacquard等[4]對硫酸銅預處理后大麥花藥中小孢子細胞超微結構進行研究，發現10 μm硫酸銅預處理后Igri 和Cork兩個基因型離體培養28 d的胚狀體中質體密度分別較小孢子提高3倍和2倍，未經硫酸銅預處理的小孢子和胚狀體中質體密度無差異；離體培養28 d后，質體基質中淀粉數量減少，類囊體和原片層體發達，并據此認為硫酸銅能促進小孢子中質體分裂及內膜的平行發育，誘導淀粉體發育成前質體，之后進入葉綠體發育進程。

1.4 子房共培養

研究表明，子房預處置培養基的應用及子房共培養可使面包小麥花藥離體培養產生的胚狀體數和分化綠苗數分別增加6倍和11倍，尤其對低花培力基因型效果明顯[12]。對不同基因型或不同發育時期的子房共培養，能顯著提升小孢子的胚胎誘導效率；與含有單核中晚期小孢子的花序子房比較，含有雙核期小孢子的花序子房可使產生的胚狀體數和分化綠苗數提高25%～46%。對子房預處置培養基及子房共培養提高胚狀體誘導率及綠苗再生率機制的基因表達分析顯示，TAA1b、FLA26、WALI6基因和小孢子胚胎發生相關，CGL1基因(與多聚糖合成和降解相關)和FER基因(和子房信號傳導過程相關)在子房共培養過程中也均有不同程度的表達和誘導[12]。

2 花藥離體培養過程中胚狀體或愈傷誘導效應的遺傳控制

花藥離體培養再生花粉植株一般經過2個過程，首先是花藥中小孢子脫分化形成胚狀體或愈傷，之后是胚狀體或愈傷分化再生花粉植株，其中小孢子脫分化形成胚狀體或愈傷是形成再生花粉植株的先決條件。研究表明，基因型是影響花藥離體培養胚狀體或愈傷形成的主要因素，不同基因型間花藥小孢子脫分化形成胚狀體或愈傷的能力差異顯著，遺傳控制復雜，可能存在多種遺傳學效應[13-16]。

2.1 小 麥

關于小麥花藥離體培養愈傷誘導是否存在細胞質效應，不同研究者因試材不同得出的結論也存在差異。有研究表明[17]，小麥品種間互交，母本效應很弱或不存在，而Ekiz等[18]和Yildirim等[19]則發現存在明顯的細胞質效應。Chaudhary等[20]通過對9個冬小麥基因型和2個春小麥基因型利用不完全雙列雜交方式獲得的F1代及其親本花藥培養特性的研究表明，愈傷誘導以非加性效應為主。Ekiz等[18]分析了4個基因型完全雙列雜交組合后代的花藥培養特性，發現愈傷誘導率的遺傳差異占總差異的92%，愈傷誘導率的一般配合力方差為74%，狹義遺傳力的估計值為0.68。小麥胚狀體或愈傷誘導能力控制基因染色體定位的研究也取得了一定進展， Szakfics等[21]采用中國春代換系的研究表明，7A和1A染色體與小麥愈傷誘導能力相關；Agache[22]利用非整倍體、代換系和易位系的研究表明，中國春的1D和5BL染色體基因增加了胚狀體的誘導效率；Nielsen等[23]采用SSR和DArT分子標記技術，對小麥雜交F3群體開展了花藥小孢子的定位研究，分別在5A和5B染色體上檢測到2個可解釋41%愈傷誘導能力變異的QTL。

2.2 大麥

大麥花藥離體培養胚狀體誘導的一般配合力和特殊配合力是相互獨立的，遺傳差異既存在加性效應，也有顯性效應，但加性效應更為重要[13,15]。Manninen等[24]采用RAPD、RFLP和SSR分子標記技術對六棱春大麥Rolfi和 Botnia構建的DH群體進行初步定位，發現了2個與大麥愈傷誘導相關的QTL，分別位于2H和4H染色體。Chen等[25]采用RAPD、STS和SSR分子標記技術，也在2H染色體上檢測到了與胚誘導相關的QTL，該位點可解釋表型變異的40.92%，并在另外一個染色體6H上也檢測到1個相關的QTL，這個位點可解釋表型變異的11.54%。通過cDNA克隆方法在大麥花藥小孢子離體培養胚胎發育早期獲得了ECA1、ECGST、ECLTP三個表達基因，其中ECA1只在離體培養早期表達；ECGST與谷胱甘肽S-轉移酶成分parA-like基因同源，其編碼蛋白可能在離體培養過程中應對氧化應激壓力的保護細胞中發揮重要作用；ECLTP基因和脂質轉移蛋白基因同源且表達模式類似，脂質轉移蛋白被認為是胡蘿卜體細胞胚胎發育中早期胚胎形成的標志[26]。

2.3 小黑麥

采用AFLP、SSR及DArTs等分子標記技術的研究表明，6B和4R染色體存在2個可解釋小黑麥胚狀體誘導表型變異30%的QTL[27]，5A、4R、5R 和7R染色體存在7個與愈傷誘導相關的QTL[28]。對8個小黑麥DH系雄核發育反應的生理學研究表明，內源和外源激素水平的平衡是雄核有效發育的保障；IAA含量和胚狀體的誘導呈顯著的負相關，低水平生長素有利于胚狀體的形成和綠色植株再生能力的提高；玉米素與胚狀體形成的能力呈正相關[29]。高的過氧化物歧化酶(SOD)活性直接決定小孢子的生存能力，小孢子胚狀體形成能力和過氧化氫的產生呈非線性正相關，與過氧化氫酶呈負相關，一定水平的過氧化氫酶閾值對胚狀體的形成至關重要[6]。Krzewska等[7]通過對4個具有不同再生能力小黑麥DH系的蛋白組學分析，初步認為烯醇化酶和12S貯藏蛋白可以做為花藥離體培養早期胚胎發育的候選標記。

3 花藥離體培養過程中綠苗再生效應的遺傳控制

花藥離體培養再生的花粉植株分為綠苗和白苗2種，其中白苗由于葉綠素缺失無法進行光合作用，不能正常生長發育成熟，苗期即停止生長。花藥離體培養再生的花粉綠苗其染色體數與配子細胞一致也為單倍體，不能結實形成種子，需經過離體培養過程或苗期的自然或人工加倍才能形成正常結實的雙單倍體植株，由于這些加倍形成的雙單倍體植株每對染色體上的成對基因均為純合基因，自交產生的后代不會發生性狀分離，可在育種工作中應用以加快新品種選育進程。

3.1 小麥

小麥花藥離體培養綠苗再生正反交效應顯著[18-19]，且以加性效應為主[20]。對4個小麥基因型完全雙列雜交組合后代花藥培養特性的研究表明，綠苗分化率及綠苗產率的遺傳組分分別占總變異的80%和77%，綠苗再生及綠苗產率的一般配合力方差分別為66%和53%，其狹義遺傳力的估計值分別為0.54和0.43[20]。小麥綠苗再生控制基因染色體定位的研究也取得了一定的進展，Lazaridou等[30]通過比較六倍體和四倍體小麥基因型的花藥離體培養特性，認為D基因組是綠苗分化所必須的。利用中國春代換系發現3A染色體與植株再生相關，2D染色體和綠苗再生相關[21]。利用非整倍體、代換系和易位系發現位于中國春的1RS染色體上的基因增加了花粉植株再生能力[22]。采用AFLP分子標記技術對50個DH群體進行基因定位，發現了4個與綠苗再生相關的QTL(QGpp.kvl-2A、QGpp.kvl-2B、QGpp.kvl-2B和QGpp.kvl-5B)，分別位于2AL、2BL和5BL染色體，這4個QTL對綠苗分化率表型變異的貢獻率之和為80%，其中5B染色體上的位點可解釋31.5%的表型變異[31]。而采用SSR和DArT分子標記技術對小麥雜交F3群體花藥植株再生頻率進行定位研究，分別在1B和7B染色體檢測到2個可解釋53%綠苗再生能力變異的QTL，其中1B染色體上的位點可解釋34%的綠苗再生能力變異[23]。

3.2 大麥

基因型是影響大麥花藥再生綠苗的主要因素，其效應占總變異的60%以上。核基因可以解釋全部的遺傳效應，未發現有核質互作效應。一般配合力可以解釋雜交種綠苗形成的全部遺傳變異[13]。Manninen等[24]利用RAPD、RFLP和SSR分子標記技術對六棱春大麥Rolfi和 Botnia構建的DH群體進行的定位研究，發現2H和3H染色體存在3個與花粉植株再生相關的QTL，其中2個位于2H染色體。Chen等[25]利用RAPD、STS和SSR分子標記技術在另外2個染色體上(5H和6H)檢測到QTL， 其中6H染色體的位點可以解釋表型變異的32.68%，5H和6H染色體的QTL可解釋綠苗再生表型變異的50.53%。Munoz-Amatrian等[32]采用AFLP分子標記結合RAPD、STS和SSR標記的方法對100個DH系進行研究，發現了2個與大麥綠苗再生相關的QTL，分別位于3H和5H染色體，可解釋表型變異的65.2%；進一步利用30個不同來源大麥優良品種對發現的QTL進行驗證，其中位于3H染色體的SSR標記HVM60，與綠苗再生率呈顯著相關，可解釋表型變異的20%。

3.3 小黑麥

Krzewska等[28]采用DArT、AFLP及SSR分子標記技術對含有90個DH株系的小黑麥群體的花培力基因定位研究表明，與花粉植株再生相關的QTL位于4A染色體上。低水平生長素有利于綠色植株再生能力的提高，玉米素與胚狀體再生植株的能力呈正相關[33]。

4 花藥離體培養過程中白苗再生效應的遺傳控制

質體是葉綠體合成及進行光合作用相關代謝的細胞器，與花粉白苗的產生關系密切。有研究認為，核、質體單獨或相互作用促使了白苗的再生，并在白苗質體基因組中發現了基因組的缺失和翻譯錯誤[33]。

4.1 小麥

小麥花藥離體培養白苗再生的正反交效應差異不顯著[19]。通過非整倍體、代換系和易位系研究發現，中國春5B染色體具有增加白苗再生效率的基因[22]。采用SSR和DArT分子標記技術對小麥雜交F3群體花粉植株再生頻率進行定位研究，在 1B和7B染色體檢測到2個增加白苗再生的QTL，可解釋55%的表型變異[23]。通過對石麥15基因型花藥離體培養再生的白苗及綠苗的RNA-Seq及蛋白組學的比較分析，發現綠苗和白苗間的差異基因主要和光合作用、卟啉及葉綠素新陳代謝路徑相關，且多數差異表達基因參與類囊體和葉綠體被膜的構建，對其中12個差異表達基因進行實時熒光定量PCR分析，驗證結果與RNA-Seq結論一致；綠苗和白苗間的差異蛋白主要與和抗氧化劑、結合、轉運、結構分子和催化活性相關[34]。

4.2 大麥

Dunford等[35]對大麥花藥離體培養產生白苗的質體基因組結構及相關的轉錄水平進行研究， Southern分析顯示，4株白苗質體基因組存在特定限制片段(AptDNAs)的缺失或改變，但有1株白苗質體基因組是完整的；所有白苗植株的DNA含量均減少，而相應綠苗葉片中含量為6%～20%。白苗核基因和質體基因編碼的質體成分的Northern blot結果顯示，與綠苗相比，白苗中未檢測到rbcL、psbD-psbC、16S和23SrRNAs基因的轉錄或轉錄水平很低；白苗中編碼葉綠體蛋白的核基因rbcS和cab的轉錄水平也很低。非質體成分的核編碼的25SrRNA在綠苗和白苗中表達水平一致，說明白苗中只有質體相關基因表達受影響。白苗中質體基因轉錄水平的降低與質體DNA變化的不同形式無明顯相關性。Caredda等[36]對冬大麥品種Igri(綠苗再生頻率為87.8%)和4個春大麥品種(只再生白苗)離體培養花藥進行了質體超微結構研究，發現這2種類型的小孢子質體發育表現為2個完全相反的路徑，Igri品種花藥離體培養過程中質體具有較多分化的類囊體，淀粉數量較少，含有DNA的質體比例較高；與此相反，4個春大麥品種花藥離體培養過程中，質體的類囊體中含有分化不充分的造粉體，質體中DNA含量較少，認為造粉體的出現是分化白苗的標志，質體的發育路徑早在小孢子發育時期就已經確定，并推測是早期花粉發育過程中質體DNA的降解引起了白苗的分化。

4.3 小黑麥

Krzewska等[37]關于90個小黑麥DH群體的定位研究顯示，3B、4B、4R、5R和7R染色體存在7個與白苗再生相關的QTL，這些QTL可解釋8.3%～17.6 %的白苗分化表型變異。進一步利用10個DH系研究了白苗再生能力與各種內生激素含量、氧化應激及抗氧化能力的相互關系，認為一定程度的氧化應激是從非光合能力的質體轉化為葉綠體所必需的，同時高效的抗氧化酶系統和內源激素平衡也很重要。

5 問題與展望

花藥培養技術在新品種選育中發揮著重要作用，國內外利用花藥培養技術已選育出一批大麥、小麥等作物新品種并在生產上應用。花藥離體培養特性主要受遺傳因素決定，但同時也受外植體生長條件及花藥離體培養條件的影響。目前不同作物的花藥培養效率差異較大，其中大麥花藥培養體系已趨于成熟，分化胚狀體及再生花粉植株能力較強，而小麥、玉米及水稻的花藥離體培養效率還有待進一步提高。受花藥離體培養表型性狀鑒定效率及準確性的制約，花藥培養特性遺傳機制的研究受到了一定程度的限制，關于花培特性遺傳控制的細胞學、生理生化、DNA、RNA及蛋白等水平的研究還相對較少。大麥是目前花培體系構建比較成熟的作物，同時因大麥是二倍體植物，且基因組測序已完成并已組裝成了1個包含4.79 Gb的大麥高質量參考基因組序列，因此，以大麥為研究對象開展花藥培養特性的基因定位及克隆等研究、解析基因表達網絡同花藥培養性狀之間的關系更易取得突破性進展，在此基礎上再進一步延伸至小麥等其他作物可能會有更好的效果。總之，今后的花藥培養特性機制解析研究要在提高花藥培養特性表型性狀鑒定準確性的基礎上，與不斷發展的現代生物學技術相結合，充分利用最新的先進技術開展相關研究工作，為克服花藥離體培養的基因型依賴性等問題提供解決辦法，進而提高花培育種的效率，為農業生產服務。