上皮細胞microRNAs防御微小隱孢子蟲感染的先天性免疫調節作用

張貴玲,王艷歌,張素梅,張龍現,王榮軍

隱孢子蟲(Cryptosporidium)是1907年由Tyzzer在實驗小鼠胃內首次被發現,目前隱孢子蟲屬內已鑒定出34個有效蟲種及60多個基因型[1-2].隱孢子蟲感染包括人類在內的多種脊椎動物宿主的胃腸道上皮細胞,在免疫功能正常的個體中主要引起急性、自限性腹瀉,而在免疫功能不全的個體中常導致較高的發病率和死亡率[3-4].C.parvum是最重要的人獸共患蟲種,在全世界最近報道的325起寄生性原蟲病的水傳暴發病例中,C.parvum占50.8%(165/325)[5].

miRNAs是一類約22個核苷酸的內源性非編碼RNAs,在細胞分化、增殖、凋亡等多種生物過程中發揮重要的調節作用[6].C.parvum感染上皮細胞后通過改變宿主基因的表達譜維持寄生蟲與宿主保護機制之間的微妙平衡[7].Zhou等分析了C.parvum感染膽管上皮細胞后成熟miRNAs表達譜,鑒定出4個miRNAs顯著上調,19個miRNAs顯著下調;Real-time RCR檢測顯示5個miRNAs(miR-125b、miR-21、miR-23b、miR-30b、miR-16)在感染后12～24 h表達增加,而在感染后2～8 h無變化[8].數據分析顯示,miR-125b-1、miR-21、miR-23b-27b-24-1和miR-30b通過啟動子連接于NF-κB亞單位P65的方式被轉錄激活;篩選P65依賴的miRNA功能抑制后增加C.parvum感染負荷.miRNA作為細胞應對環境應答的微調機制,參與宿主細胞防御微生物感染的免疫反應.C.parvum感染上皮細胞也為探索miRNA介導的防御機制提供理想模型.本文主要概述了參與防御C.parvum感染的宿主miRNAs以及調控機制.

1 Let-7i

Let-7基因最初作為秀麗隱桿線蟲的關鍵發育基因被發現[9].研究顯示,let-7家族的miRNA由編碼9個不同的成熟let-7 miRNAs的let-7a至let-7i的12個基因組成,在細胞增殖、分化中發揮重要的作用[10].Let-7家族 miRNAs與SNAP23 3′UTR之間存在保守的互補性,C.parvum感染上皮細胞后,激活TLR4信號通路,減少let-7表達,解除let-7 miRNAs對SNAP23的翻譯抑制,增加SNAP23表達,釋放導管素-37、β-防御素2等外質體,抑制C.parvum活性[11].

Let-7i作為miRNA let-7家族的成員之一,誘導沉默信息調節因子1(SIRT1)表達,調節TLR4/NF-κB信號通路介導的上皮細胞防御C.parvum感染的炎癥反應[12].Chen等報道,C.parvum感染人類膽管上皮細胞可通過激活My D88/NF-κB信號通路減少let-7i表達,解除let-7i介導的SIRT1翻譯抑制,SIRT1過表達促使NF-κB的Rel A/P65亞基發生去乙酰化作用,抑制NF-κB激活,負反饋調節TLR4/NF-κB信號通路,消除NF-κB介導的炎癥反應[13-15].體外實驗證明,let-7i與TLR4 m RNA 3′UTR區域結合以翻譯抑制方式降低C.parvum誘導的TLR4的水平[16].NF-κB P50和C/EBPβ屬于b-Zip轉錄因子家族,C.parvum感染上皮細胞后,NF-κB p50和C/EBPβ形成沉默復合體,結合到let-7i啟動子上,啟動組蛋白-H3脫乙酰作用并抑制let-7i轉錄,解除let-7i介導的TLR4的翻譯抑制,進一步激活NF-κB信號通路,促進防御C.parvum感染的固有免疫應答[17].

2 miR-98

C.parvum感染上皮細胞的體外實驗證明,miR-98靶向SOCS4的3′UTR區域,通過轉錄后水平抑制SOCS4表達.CIS和SOCS蛋白是細胞內的分子家族,在許多細胞類型中主要作為細胞因子應答的生理學調節蛋白發揮作用[18].每個CIS/SOCS蛋白都有一個SH2域和一個SOCS盒,SH2域與底物上磷酸化的酪氨酸殘基結合,同時,CIS/SOCS蛋白的E3活性可引起底物的泛素化以進行蛋白酶體降解[19].CIS/SOCS蛋白起著E3泛素化連接酶的功能,與JAK/STAT信號級聯相互作用介導被激活的細胞因子信號復合體的降解,引起負反饋調節.

Zhou等報道,C.parvum感染上皮細胞后,通過TLR4/My D88信號通路減少miR-98表達,解除miR-98介導的CIS/SOCS4的翻譯抑制,CIS/SOCS4表達增加,抑制C.parvum誘導的STAT3和STAT6的磷酸化,最終促進上皮細胞防御C.parvum感染[20].

3 miR-27b

miR-27b是一種內源性調節RNA,C.parvum感染上皮細胞后,激活宿主細胞TLR4/NF-κB信號通路,增加miR-27b表達.miR-27b通過靶向KSRP 3′UTR區域,引起翻譯抑制,減少KSRP表達.KSRP是一種RNA結合蛋白,與3′UTR內具有AREs的m RNA相互作用.iNOS m RNA的3′UTR區域含有ARE序列,KSRP與iNOS m RNA的3′UTR區域AREs結合,調節iNOS m RNA的穩定性從而調節iNOS表達[21].研究顯示,KSRP shRNA可消除miR-27b前體對iNOS m RNA穩定性的影響.通過體外和動物模型研究表明,上皮細胞中NO產物主要由iNOS調節,NO可通過直接殺死或限制寄生蟲生長的方式促進宿主防御微生物感染的固有免疫應答[22].因此,當C.parvum感染上皮細胞后,通過NF-κB途徑增加miR-27b表達,減少KSRP表達,增加iNOS m RNA穩定性,iNOS促進NO生成,最終通過固有性免疫應答抵抗C.parvum感染[23].

4 miR-513

研究表明,膽管上皮細胞通過表達幾個B7協同刺激分子應答炎癥刺激[24].B7-H1作為B7協同刺激分子B7家族關鍵的成員,參與調節細胞介導的免疫應答[25-26].在人類膽管上皮細胞中,miR-513靶向B7-H1的3′UTR區域,介導蛋白質的翻譯抑制[27].體外研究表明,C.parvum感染上皮細胞后,miR-513表達減少,解除B7-H1的3′UTR區域結合位點的翻譯抑制,增加B7-H1表達,B7-H1可連接活化的T細胞誘導凋亡細胞死亡,最終引起防御C.parvum感染的炎癥反應[28].

5 miR-221

m RNA的3′UTR區域能特異性的控制個體mRNA的翻譯率和降解率,也可作為miRNA靶標[29].在人類膽管上皮細胞中,miR-221靶向細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的3′UTR區域,誘導內源性翻譯抑制.ICAM-1是由包括內皮細胞和上皮細胞在內的幾種細胞類型表達的Ig超家族的90 k D成員,可穩定細胞間的相互作用.微生物感染后,促炎癥分子IFN-γ通過STAT-1機制抑制miR-221表達,解除miR-221對ICAM-1 3′UTR的翻譯抑制,促進ICAM-1表達[30].C.parvum感染人類膽管上皮細胞后,抑制miR-221表達,ICAM-1表達增加,促進上皮細胞黏附分子釋放,幫助上皮細胞識別淋巴細胞等免疫細胞,激活適應性免疫反應[31].

6 miR-424/miR-503

組蛋白乙酰轉移酶和脫乙酰酶(HDACs)主要由HDAC1、HDAC2和HDAC類型3(Sirt1)組成,組蛋白乙酰化是控制染色質結構、DNA可及性和基因表達的關鍵表觀遺傳機制,可引起染色質結構解開,允許轉錄因子進入啟動子位點[32-33].當HDAC促進脫乙酰化時,HDAC功能的抑制增加組蛋白的乙酰化作用并激活基因轉錄,同時,HDAC抑制劑可抑制NF-κB信號通路誘導的細胞因子分泌.趨化因子CX3CL1是CX3C家族獨特的成員,它僅與其受體CX3CR1結合并且是其獨特的配體,CX3CL1以膜結合形式表達,以可溶性趨化形式脫落,它作為黏附分子與表達CX3CR1的免疫細胞相互作用,包括CD4＋、CD8＋、T細胞、NK細胞和單核細胞[34-36].miR-424和miR-503靶向CX3CL1相同3′UTR區域,啟動CX3CL1 m RNA的降解.Zhou等報道,C.parvum感染人類膽管上皮細胞后,誘導miR-424和miR-503基因啟動子的NF-κB結合區域相關的p50-C/EBPβ-Sirt-1/HDAC復合物形成,抑制miR-424和miR-503基因表達,解除CX3CL1 mRNA的降解.通過小鼠膽囊注射C.parvum卵囊證明CX3CL1增加CX3CR1＋向膽道粘膜周圍滲透,最終通過HDACs和NF-κB信號通路促進上皮細胞粘膜免疫從而防御C.parvum感染[37].

7 小 結

綜上所述,宿主miRNAs通過多種途徑調節上皮細胞防御C.parvum感染免疫反應的諸多階段,諸如let-7i和miR-27b通過TLR4/NF-κB信號通路調節宿主上皮細胞的免疫反應,miR-98通過JAK/STAT信號通路調控宿主細胞抗C.parvum的免疫反應,miR-513和miR-221分別通過調控上皮細胞與T細胞、淋巴細胞等免疫細胞的相互作用,調節宿主細胞防御C.parvum的炎癥反應,miR-424和miR-503通過HDACs和NF-κB信號調節宿主細胞抗C.parvum感染.目前,C.parvum可以通過調控感染細胞中miRNAs的表達,形成有效的免疫逃避機制,從而抵御宿主細胞的防御[38];而對于宿主miRNAs在防御C.parvum感染免疫方面還有許多難題待研究,比如,宿主原代上皮細胞的分離與C.parvum體外感染細胞模型的建立、C.parvum體內感染動物模型的建立、體內外上皮細胞miRNAs在防御C.parvum感染免疫調控中的功能及其分子機制研究等.因此,深入了解調控上皮細胞防御C.parvum感染的復雜分子網絡中的miRNAs的功能,不僅促進對C.parvum發病機制的認識,也為鑒定黏膜表面感染干預性治療的新靶點提供依據.