代謝組學技術及其在重要寄生原蟲研究中的應用

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1 前 言

寄生原蟲是危害人類和動物健康的主要病原之一，其危害性以食源性寄生原蟲病為主[1]，由于人們生食或半生食習慣，使得寄生原蟲病的發病率大幅度升高。在畜牧業生產中，某些寄生原蟲損壞動物的消化系統，使飼料動物體內的利用率降低，從而使養殖成本提高，對畜牧業造成巨大的經濟損失。在公共衛生學方面，很多寄生原蟲對人類有致病性，并且很多是機會致病性寄生原蟲，當機體免疫正常時，這類寄生原蟲感染機體后通常處于隱性感染狀態，致病力弱而被忽視。一旦機體免疫受損，蟲體出現大量繁殖和強致病力，嚴重危害著人類的健康[2]。

而在寄生原蟲的研究中，組學的相關研究方法已廣泛被應用。特別是后基因組學、蛋白質組學、轉錄組學研究方法尤為明顯。但隨著對寄生蟲組學研究的深入，遇到的問題也愈顯復雜，很多問題難以用以上三種組學研究方法解決，這三種研究方法處在生物系統生化活動調控的起始階段，反映的是正在發生而非終止的生物學事件，因此這些分析方法所提供的信息不足以揭示生物體系生理和生化功能狀態，而且在這些技術的應用過程中需要建立大量的超大序列標簽數據庫，再加上基因和蛋白質的種類多，這給寄生蟲的研究帶來了相當大的麻煩。因此一種新的寄生蟲研究技術——代謝組學技術應運而生。

本文通過對代謝組學技術，代謝組學研究方法以及代謝組學在重要寄生原蟲(主要是弓形蟲、利什曼原蟲、瘧原蟲、錐蟲)領域的應用展開綜述，把握當前代謝組學在寄生原蟲研究中的最新動態，為今后寄生原蟲代謝組學研究提供參考。

2 代謝組學簡介

代謝組指在一個細胞中代謝物的總和[3]，由Nicholson等[4]最早提出，代謝組學是指研究在生物系統代謝的代謝途徑及其受到刺激產生的所有代謝物變化的科學，這些代謝物包括不同級別分子質量小于1000的內源性小分子化合物[5],它的起源以代謝控制分析、核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)光譜學的發展為兩個獨立的出發點[6]。

代謝組學主要借助NMR、色譜(Chromatography)、質譜(Mass Spectrometry，MS)，氣相色譜-飛行時間質譜(GC-TOF/MS)等技術進行代謝組學研究，各種方法都有其獨特的優點，往往單獨應用于不同的研究中。但代謝組具有相當復雜的分子種類及濃度范圍，單一技術往往難以達到研究目的，因此代謝組學研究中往往不局限于選擇單一的技術，而是通過不同的分析技術的組合達到全面把握代謝組內容的目的[7]。

代謝組研究的目標是能夠提供生物樣品中存在的所有代謝物的復合譜。在代謝水平的細胞分析與轉錄組和蛋白質組分析相比具有許多優點，Janet等[8]總結了以下四個方面：1)基因和蛋白質表達的變異可以引起代謝中的變化放大，使檢測更容易。2)代謝組學技術不需要完整的基因組序列或大的EST數據庫。3)與基因或蛋白質相比，代謝物類型更少：每個生物體1 000個數量級。4)該技術更通用，因為給定的代謝物在每個生物體中是相同。

代謝組學在生物學研究中已經進入到一個新穎的多學科領域，它為許多研究人員提供了一個將生物化學、統計學、計算機學與深入研究生物學與疾病有力結合的平臺[9]。代謝組學現已廣泛應用于疾病診斷、藥物開發、微生物代謝以及動植物代謝等研究中[10]。

3 代謝組學研究方法

代謝組學的終極目標是實現全面、定量分析生物系統中的所有代謝產物，使其與生理特征更為相似。但樣品中代謝物具有非常不同的生化特性，并且以不同的豐度水平存在[11]，因此，代謝組學技術在不同的研究對象中研究目的和方法會有所不同[12]，但其研究方法流程大體可包括三個過程：代謝物的提取、樣品分析以及數據分析[13]。

3.1代謝物的提取 代謝物的提取包括代謝物的制備以及預處理。從一個生物樣品中提取最完整的代謝產物也許需要不同的制備方法[14]。對于微生物而言，至少需要順序和同步兩種的萃取過程。前者需要單獨與連續淬火和代謝物提取步驟，而在后者淬火和提取都是在單個步驟中執行。代謝物提取效率高低取決于所使用的微生物和提取程序，微生物的性質似乎決定了提取的最佳方法[15]，所使用的萃取試劑會決定提取效率和提取到的代謝物的品質，例如，Mehta等[16]研究者使用皂苷使紅細胞釋放寄生蟲，從而能特異性地分析寄生蟲代謝物。

由于小分子可通過快速改變應對環境的變化，這就很難保障樣品的完整性，而適當的樣品預處理方法也許可以解決這一問題。比如，快速淬火以捕捉代謝活動，通常涉及溫度迅速降低或增加，捕捉酶活性代謝物之后隨之而來的是提取物與提取溶劑的混合。最理想的淬火方法是使用冷甲醇或水組合，但其他幾個試劑組合也會被使用[16]，例如Wang等[17]研究發現常規采用的甲醇比-80 ℃的生理鹽水猝滅大腸桿菌更能引起細胞膜破壞，由此證明-80 ℃的生理鹽水猝滅大腸桿菌更加保留了代謝物的完成性。

3.2代謝物樣品分析 代謝物的分析，主要借助于各種先進的分析技術，比如NMR，色譜，MS及其三者之間的聯用等。

色譜分離技術是一個代謝物分離的關鍵技術，可在極其復雜的整體分析中，將混合物小分子分離開來。目前用于分離的色譜分離技術主要包括氣相色譜法，液體色譜法和毛細管電泳[18]。憑借其高效分離率、設備簡單、選擇性強等優勢廣泛用于代謝組學研究的各領域中，袁凱龍等[19]利用氣相色譜技術分析服用洛沙坦后的糖尿病人尿樣，發現葡萄糖醇和肌醇等代謝物發生變化，并且證實了藥物療效的發展過程能夠用機體不同時間點的代謝物變化軌跡進行描繪。S cubbon等[20]使用LC-MS分析人類尿液樣品，證實了反相分離與親水相互作用色譜是增加LC-MS代謝組學研究指紋覆蓋率的合適方法。

MS技術是一種鑒定技術，在有機分子的鑒定方面發揮著重要作用，能夠快速準確地測定生物分子的分子量。質譜通常與色譜聯用[21]具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離鑒定同時進行的優點[22]，是代謝組學領域重要分析技術之一。Yang 等[23]將高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)技術應用于慢性乙型肝炎的肝功能急性惡化的調查以找到潛在的生物標志物，實驗結果鑒定了幾種慢性乙型肝炎急性惡化時潛在的生物標志物：溶血磷脂酰膽堿(LPC)和甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)或其異構體甘油脫氧膽酸(GDCA)。

NMR是研究高分子鏈結構的重要手段，是鑒定有機物結構和研究化學動力學的重要方法，既可用于定性分析，又可用于定量分析[24]。NMR樣品預處理過程相對簡單;且對樣品的損傷小,可在更接近生理條件下進行實驗，實時和動態的檢測，利用NMR譜中信號強度與樣品濃度的關系, 可對代謝物進行定量分析[25]，這就使得NMR在代謝組學研究領域中不可或缺。Carrola等[26]利用NMR技術調查肺癌患者的尿液代謝標志，證實了馬尿酸鹽、β-羥基異戊酸鹽、肌酐等是促進這種肺癌鑒定的主要代謝物。

這三種分析技術在代謝組學的應用中必不可少，根據各自的優點，都實現了其在代謝組學研究中的重要價值。三種技術之間聯合應用，不僅實現三種技術優缺點的互補更是讓各自的優點得到最大化的發揮，使代謝組學能解決研究中更多的疑難問題。

3.3數據分析 代謝組學分析技術分析樣本，最終都會得到決定樣品的特征定量數據集。然而這些數據龐大，一般的統計分析方法很難發現樣品間的差異及其造成這些差異的原因[27]。因此，就出現了針對代謝組學研究的分析方法，主要包括兩大類，無監督模式和有監督模式識別方法，前者主要包括聚類分析法、神經元網絡分析法、主成分分析法等，后者主要包括偏最小二乘法判別分析(PLS-DA),正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)等[28]。根據研究目的和研究方法的不同，合理選擇對應的數據分析方法。朱曉陽等[29]綜合應用LS-DA、OPLS-DA、主成分分析等分析方法分析數據，結果發現鼠傷寒沙門氏菌在共感染小鼠中發揮了作用，并且降低了日本血吸蟲病對小鼠的影響。而Sengupta等[30]利用主成分分析(MPCA)方法，對雌雄小鼠的肝、腦、血清代謝分布進行多途徑分析，分析表明了在疾病早期有明顯的性別二態性，而在腦血清相關性分析發現了兩性的能量代謝發生改變，進一步證實疾病進展期間的差異細胞器反應對瘧疾操縱有影響。

4 代謝組學在重要寄生原蟲研究領域的應用

代謝組學技術在寄生原蟲研究中的應用相對較少，主要應用在公共衛生影響較大的寄生原蟲，相關研究已經取得了突破性進展，本文通過大量的文獻檢索，總結了寄生蟲代謝組學在重要寄生原蟲研究中的應用，主要包括弓形蟲、錐蟲、利什曼原蟲和瘧原蟲。

4.1弓形蟲 弓形蟲是一種最常見的寄生蟲，危害性極大，幾乎能感染所有的脊椎動物物種，包括人類[31]。弓形蟲是寄生蟲研究領域最熱門的寄生蟲之一。各種生物學研究方法幾乎都有所涉及，逐漸興起的代謝組學技術也應用在弓形蟲的研究中。Srinivasan等[32]使用聯合遺傳、生化和代謝組學方法描繪了脂肪酸生物合成的兩種途徑在弓形蟲的分子活性，并證實了質膜是脂肪酸的重要來源，其產物在寄生蟲內質網中進一步修飾。Zhou[33]等研究者對弓形蟲感染后的小鼠腦進行全代謝組學分析，對剛地弓形蟲感染的小鼠代謝組學分析變化進行研究，發現其腦碳水化合物代謝、脂質代謝、能量代謝和脂肪酸氧化代謝組學途徑發生改變。利用LC-MS分析技術，主成分分析等分析方法鑒定了與感染引起的疾病的身體恢復相關的八種代謝物，并且檢測到的干擾代謝物和干擾途徑可為發現新的治療和診斷應用的新靶標提供有價值的信息。Zhou等[34]在另一研究中使用液相色譜-質譜法在弓形蟲病發病期間小鼠血清的代謝組學分析，確定了與氨基酸代謝和能量代謝相關的19種失調的代謝物，為未來研究提供了推定的代謝物生物標志物。

4.2錐蟲 錐蟲分為兩大類涎源性錐蟲和糞源性錐蟲，前者包括岡比亞錐蟲與羅得西亞錐蟲是非洲錐蟲病的病原體[35]，全球約有一千萬人感染克氏錐蟲(Trypanosomecruzi)，約四千萬人存在被感染的風險[36-37]。研究錐蟲病，以病原的研究為主要思路，而錐蟲代謝組學研究是一個新的出發點，相關研究已被大量報道。Vincent等[38]使用代謝組學技術在不同疾病階段探測來自感染了布氏錐蟲患者的腦脊髓液(CSF)，血漿和尿液樣品，發現新蝶呤和5-羥色氨酸在階段1和階段2晚期之間顯示出100%的特異性和靈敏度；5-羥色氨酸是5-羥色胺合成途徑中的重要代謝物，決定嗜睡的關鍵途徑；并且從血漿分析發現存在疾病階段的幾種生物標志物。Li等[39]使用基于1H NMR光譜的代謝分析研究了NMRI小鼠對布氏錐蟲的代謝反應,發現感染布氏錐蟲后2-氧代異己酸鹽、D-3-羥基丁酸鹽、乳酸鹽、4-羥基苯基乙酸鹽、苯基丙酮酸鹽和4-羥基苯基丙酮酸鹽的濃度增加，并且馬尿酸鹽水平降低，證實了丙酮酸鹽，苯丙酮酸鹽和馬尿酸鹽與寄生蟲血癥相關。Almutairi等[40]利用代謝組學分析蜂膠抗布氏錐蟲的效應，揭示了新的蜂膠抗布氏錐蟲的活性成分，并證實在蜂膠中存在一些潛在的治療化合物，可用作新的藥物開發。

4.3利什曼原蟲 利什曼病是一種熱帶地區的致衰弱疾病[41]，約20種利什曼原蟲屬引起人類感染[42]。對于利什曼原蟲的研究中，代謝組學研究是重要的研究方法之一。Canuto等[43]研究人員應用代謝組學技術探究利什曼原蟲對米替福星作用和耐藥機制，利用GC、LC、和CE耦合到MS獲得了寄生蟲代謝變化的圖片，并發現氨基酸水平的增加是抗性寄生蟲最突出的特征，證實了銻和MT部分交叉抗性的可行性，因此可找到新的多胺途徑抑制劑與米替福新藥物組合，甚至用作抗性的逆轉劑，開啟新的替代方案，以減少對利什曼原蟲的用藥。Vincent等[44]運用非目標代謝組學描述涉及米替福新作用的代謝變化，檢測到超過800種代謝物，并發現抗銻細胞具有與野生型細胞相似的內部代謝物水平。詳細了解米替福新作用模式對于指導聯合治療來防治利什曼病至關重要。Santos等[45]用兩種不同的兩性霉素B(AmB)制劑，負載AmB和常規制劑(C-AmB)的納米乳劑(NE)處理觀察小鼠的代謝變化，鑒定出約30種代謝物與早期C-AmB誘導的腎毒性有潛在的相關性。在C-AmB處理的小鼠中觀察到花生四烯酸，甘油磷脂，?；鈮A和多不飽和脂肪酸(PUFA)途徑的干擾。在裝載了AmB的NE組中，觀察到代謝變化較少，包括皮質醇和吡喃糖等離子體水平的變化。該研究發現的候選生物標志物可用于檢測AmB制劑誘導的腎損傷的發病和嚴重程度。

4.4瘧原蟲 感染惡性瘧原蟲對人類的代謝狀態具有嚴重和潛在的致命后果。每年約有300萬人死于瘧疾[46]，世界各大科研機構都會投入大量的基金研究瘧原蟲，代謝組學技術研究是重要的研究方法之一。Sengupta等[47]使用基于1H NMR的代謝組學技術在非致死性的伯氏瘧原蟲感染小鼠后，在其體內建立自清除瘧疾模型，結果顯示在寄生蟲血癥峰值以及寄生蟲感染后清除三周，未感染和感染的小鼠之間存在不同代謝狀態；而且在峰值感染和恢復的反應表現出不同的性別差異；觀察到乙酰膽堿在兩種性別的大腦代謝分布中的積累，這可能對了解瘧疾后神經綜合征的病理生理學有著重要的暗示作用。Olszewski等[48]描述了基于質譜的代謝組學分析的寄生蟲在紅細胞48h內發育周期變化情況，結果顯示許多代謝物與發育周期有著對應變化，表明了寄生蟲對系統精氨酸消耗可能是人類瘧疾低精氨酸血癥與腦瘧疾發病相關的一個重要因素。Li等[49]使用高分辨率1H NMR光譜和多變量數據分析技術表征小鼠感染伯氏瘧原蟲后的代謝變化，結果發現糖酵解上調和伯氏瘧原蟲感染的能量需求增加有關。還發現了伯氏瘧原蟲感染小鼠后尿中出現了卵清酸，這表明代謝譜可提供瘧原蟲感染的診斷工具。

5 結 語

代謝組學目前主要應用于藥物研發、疾病監測等領域，經多年的研究探索，研究方法逐漸趨于成熟。但代謝組學研究中依然有很多技術有待優化，例如將大型儀器的小型化，使其更方便快捷，解決方法學需要進一步的標準化和程序化，代謝產物數據庫也需要進一步完善等。

在重要寄生原蟲代謝組學的研究方面，對寄生原蟲與藥物作用的代謝組學分析、寄生原蟲感染宿主的代謝反應、生物診斷標志物的鑒定以及宿主與寄生原蟲之間相互作用，已經有比較深入的研究。但從整體來看寄生原蟲代謝組學的相關研究較少，而且涉及范圍較窄，研究的寄生原蟲較多的是本文綜述的四種與公共衛生緊密相關的寄生原蟲。

相信隨著代謝組學技術的逐漸成熟以及新的分析方法的逐步建立，寄生蟲代謝組學的研究會更加深入，研究范圍也會進一步加大，研究的寄生蟲也不再局限于只對公共衛生息息相關的寄生蟲，而對畜牧業生產影響較大的寄生蟲，比如：球蟲、蠕蟲等及其感染宿主的代謝組學研究必將得到加強。

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