環狀RNA:心臟疾病治療的新靶點

李 根，柴 璐，蔣雅楠

（哈爾濱醫科大學藥學院藥理學教研室，黑龍江哈爾濱 150081）

據世界衛生組織統計數據顯示，心血管疾病已成為全球首要致死原因，占世界總死亡人數的31%［1]。依據《中國心血管病報告2017》，我國心血管病占城鄉居民總死亡原因的首位，患者人數約2.9億，且患病率及死亡率仍處于上升階段［2]。

隨著生物醫學的發展，非編碼RNA的生物功能和作用機制逐漸被揭示。環狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類在真核細胞中廣泛存在的特殊非編碼RNA，大多通過5’端和3’端的反向剪接形成閉合環狀結構，少部分由內含子直接環化而成。由于circRNA不具有5‘端帽子和3’端poly（A）尾結構，不易被RNA酶降解，因而比線性RNA更穩定。circRNA在不同物種間保守性高，其表達不僅具有組織器官特異性和時空特異性，而且可在DNA、RNA和蛋白等多層面發揮基因表達調控作用［3-4]。本文綜述心臟circRNA研究進展，以期為心臟疾病的防治提供新思路。

1 circRNA在心肌中的表達及其與心臟發育的關系

最近的一項研究對人和小鼠心肌及人胚胎干細胞衍生心肌細胞（human embryonic stem cellderived cardiomyocytes，hESC-CM）中circRNA表達進行檢測，分別在人和小鼠心肌中發現15 318和3017個circRNA［5]。人心肌表達最豐富的circRNA為circSLC8A1-1，其不僅是潛在的心肌細胞生物標志物，而且也有望應用于心臟疾病的診斷［6]。豐度高的circRNA對應心臟的關鍵基因，包括基聯蛋白（titin，TTN）基因、蘭尼定受體2基因和杜氏肌營養不良基因。其中，TTN是人類最長的轉錄本，可產生多達415個不同的外顯子circRNA［5]。另一項研究在人、大鼠和小鼠心肌中分別發現了13 074、8764和5868個circRNA，其中的1288個circRNA為三者所共有，提示circRNA具有較高的保守性［7]。在小鼠心臟發育過程中，其豐度呈下降趨勢［5]。后續研究提出，circRNA表現出獨立于其宿主基因的動態表達模式，與心肌的分化密切相關［8]。此外，circRNA也在人多能干細胞衍生心肌細胞（human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes，hiPSC-CM）發育和應激反應中動態表達，并可能與核糖體和RNA誘導沉默復合物相互作用［9]。這些研究提示，circRNA在心臟發育過程中發揮關鍵作用，但其確切分子機制仍需深入研究。

2 circRNA在心臟疾病中表達的變化和診斷治療意義

2.1 糖尿病性心肌病

糖尿病是誘發心肌纖維化的重要原因，可導致心功能下降，甚至慢性心力衰竭。circRNA在糖尿病性心肌病中異常表達，并參與疾病發展過程。在糖尿病d b/d b小鼠心肌組織中發現4 3個circRNA異常表達，其中2 4個上調，1 9個下調［10]。circRNA_010567表達顯著上調，其可通過吸附微RNA-141（miR-141），增加轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）表達，進而促進纖維化發展過程。沉默circRNA_010567，進而下調T G F-β1，抑制Ⅰ型、Ⅲ型膠原及α-平滑肌肌動蛋白（α-smoothmuscle actin，α-SMA）表達［9]。與此相似，circRNA_00203在糖尿病小鼠心肌和血管緊張素Ⅱ處理的小鼠心臟成纖維細胞中表達上調。其過表達可通過吸附m i R-26 b-5 p，增加Ⅰ型、Ⅲ型膠原及α-S M A表達，進而促進纖維化發展進程［11-12]。另有研究顯示，miR-142-3 p在Ⅰ型糖尿病小鼠心肌組織中表達顯著降低，預測其靶circRNA有1 4個。對這些circRNA基因進行基因本體（geneontology，GO）分析，發現其可能參與代謝、氧化還原、Notch信號通路、酶催化、蛋白加工、蛋白糖基化、小RNA出核、脂肪酸B氧化和糖原加工等生物學過程。京都基因與基因組百科全書通路分析發現，mmu_circ_0001460可通過調控Akr1b 8基因參與糖脂代謝過程；mmu_circ_0001800及0001801通過調控A ph1b基因影響Notch信號通路；而其0002281通過調控Man1a基因參與糖原生物合成和內質網蛋白加工。上述circRNA是否通過行使這些功能參與心肌病的發展，還有待后續實驗證明［13]。上述研究提示，circRNA在糖尿病性心肌病中發揮重要作用，circRNA_010567和0 0 0 2 0 3等有望成為糖尿病性心肌病治療的新靶點。

2.2 心律失常

一項針對血漿circRNA與心房顫動的相互關聯研究報道，通過circRNA芯片檢測，發現房顫患者血漿中的3 1個circRNA表達顯著失調，包括2 4個上調及7個下調［14]。hs a_circRNA_0 2 5 0 1 6在新發房顫患者血漿中表達顯著增高，有望成為預測術后房顫的標志物，實現更準確定位患者及提高預防性治療效果的目的［14]。另一項研究發現，circRNACDR 1 as在急性心肌梗死患者血漿中表達顯著升高，其表達水平與患者心電圖Q T間期離散度增加及室性心律失常發生呈正相關［15]。mi R-1等mi RNA在心律失常的發生中具有重要作用［16]。以m i R-1為例，根據star Basev 2.0（http：//star base.sysu.edu.cn/star base 2/index.php）預測，共有4 5 4個circRNA可與m i R-1靶向結合，這提示可能存在大量circRNA參與調控心律失常進程。雖已發現大量circRNA在心律失常中發生表達改變，但其對心律失常的作用和機制仍有待深入研究。

2.3 心肌梗死

心肌梗死發病快，死亡率高，嚴重危害人類生命健康。因此，尋找有效的生物標志物，快速、準確且特異性地識別急性心肌梗死后左心室重構和功能障礙對挽救患者生命至關重要。一項研究對急性ST段抬高型心肌梗死患者和健康志愿者的外周血中circRNA表達進行比較分析，在檢測的882個circRNA中，患者外周血中有460個表達上調，422個表達下調。外周血circRNA_30741表達水平顯著高于正常健康對照者。生物信息學分析顯示，circRNA_30741參與調控miR-21，miR-188，miR-568和miR-655［17]。然而，其是否通過調控miRNA參與心肌梗死目前尚不清楚。另一項研究發現，心肌梗死相關環狀RNA（circRNA MICRA）來源于位于染色體15q22的鋅指蛋白609（zinc finger protein 609，ZNF609）基因的第一外顯子區，其在心肌梗死患者血中表達顯著降低。circRNA MICRA的低表達與左心室功能異常密切相關，這項研究有助于早期評價心肌梗死患者預后［18]。

動物實驗結果發現，circRNA Cdr1as在心肌梗死模型小鼠心肌及低氧誘導的心肌細胞中高表達。其過表達可通過吸附miR-7a，進而抑制miR-7a的靶基因多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）及轉錄因子SP1表達，促進小鼠心肌細胞凋亡，而過表達miR-7a可逆轉Cdr1as的作用［19]。線粒體分裂與凋亡相關環狀RNA（circRNA MFACR）在缺血再灌注小鼠心肌和缺氧/復氧處理小鼠心肌細胞中表達顯著增高，其可直接吸附并進而下調，miR-652-3p靶基因MTP18，促進心臟線粒體分裂和心肌細胞凋亡。相反，敲除MFACR可減少缺氧/復氧導致的線粒體分裂，減少心肌梗死面積［20]。因此，circRNA Cdr1as和MFACR是潛在的心肌梗死診斷治療靶點。

2.4 冠心病

冠心病全稱為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病，是誘發心肌梗死進而導致心源性猝死的重要原因。人類全基因組關聯分析（genome-wide association studies，GWAS）發現，染色體9p21.3上INK4/ARF（CDKN2a/b）位點可轉錄生成線性的長非編碼RNA（lncRNA）和circRNA ANRIL，其單核苷酸多態性與動脈粥樣硬化風險密切相關［21-22]。進一步研究發現，INK4位點反義非編碼環狀RNA（circRNA ANRIL）可通過調控核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）發揮抗動脈粥樣硬化作用。在血管平滑肌細胞和巨噬細胞中，circRNA ANRIL可結合一個重要的60S-核糖體前體的裝配因子——pescadillo同源物1（pescadillo homologue 1，PES1），進而影響核酸外切酶介導的rRNA前體加工和核糖體合成，誘導核仁應激和P53激活，導致細胞凋亡和生長抑制。因此，circRNA ANRIL可能成為緩解動脈粥樣硬化的新靶點［23]。最近的研究提示，circRNA對冠心病也具有診斷意義。冠心病患者外周血中22個circRNA發生差異表達，12個上調，10個下調。其中，hsa_circ_0124644在冠心病患者中顯著上調，與SYNTAX評分呈正相關，且曲線下面積（area under the curve，AUC）最大［24]。hsa_circRNA11783-2在冠心病和2型糖尿病患者外周血中表達顯著下調，預測其可能作為“miRNA海綿”吸附miR-608和miR-3907發揮生物學功能［25]。circTCF25在冠心病患者外周血單核細胞中表達水平顯著降低，與空腹血糖、肌酸激酶和Gensini評分呈負相關，其表達水平每增加一個單位，冠心病發病風險就降低45%［26]。因此，hsa_circ_0124644、hsa_circRNA 11783-2和circTCF25是潛在的冠心病診斷生物標志物。

2.5 心力衰竭

已有研究發現，circRNA可通過調控miRNA參與心衰的發生。miR-223在心衰小鼠和患者心肌中表達顯著上調，可靶向抑制活性調節細胞骨架相關蛋白（activity regulated cytoskeletal-associated protein，Arc）表達。過表達miR-223轉基因小鼠出現心肌肥厚和心衰表型，而敲除miR-223可抑制異丙腎上腺素誘導的心肌肥厚。心臟相關環狀RNA（circRNA HRCR）在異丙腎上腺素或主動脈縮窄處理的小鼠心肌中表達顯著下調。促進其表達可通過抑制miR-223，進而抑制心肌肥厚和心衰的發生［27]。在心肌梗死誘導的心衰小鼠心肌中，29個circRNA上調，34個下調。而且，TargetScan和miRanda預測mmu_circRNA_013216可能與miR-181a-3p，486a-5p和486b-5p存在相互作用關系，mmu_circRNA_010567可能與miR-124，miR-141和miR-200a存在相互作用關系，它們可能通過miRNA調控基因表達，其功能和機制還有待進一步研究［28]。

2.6 心臟衰老

circRNA在心臟衰老時發生變化，并與心臟衰老過程密切相關。叉頭框蛋白環狀RNA（circRNA Foxo3）在老年患者、小鼠心肌組織和過氧化氫處理的多種小鼠細胞（如小鼠胚胎成纖維細胞、小鼠乳鼠心臟成纖維細胞、小鼠成纖維細胞N I H 3 T 3、小鼠黑色素瘤細胞B 1 6、原代培養的小鼠乳鼠和1 2周齡小鼠心肌細胞）中均高表達［29]。在多柔比星處理的小鼠中，circRNA Foxo 3表達增高可加重心肌病變，而抑制其表達可緩解多柔比星的作用。在小鼠胚胎成纖維細胞中，沉默circRNA Foxo 3可抑制細胞衰老，而過表達可促進細胞衰老［29]。進一步研究發現，circRNA Foxo 3主要分布于胞漿，其可與D N A結合抑制劑1，E 2 F轉錄因子1以及抗應激蛋白局部粘著斑激酶和低氧誘導因子-1 α相互作用，使之不能發揮抗衰老和抗應激作用［29]。另一項研究發現，circRNA Foxo 3與細胞周期進展密切相關，其在小鼠心肌成纖維細胞中高表達，可使細胞停滯在G1期而無法過渡到S和G2期，而干擾circRNA Foxo 3可促進細胞增殖［30]。這2項研究提示，circRNA Foxo 3可能成為延緩心臟衰老的新靶點。

3 展望

隨著生物醫學研究手段的發展，非編碼RNA的功能越來越受到關注，尤其是circRNA的發現開辟了新的研究領域。circRNA不僅在個體發育和疾病發生中起重要作用，而且有望成為新疾病的生物標志物和治療靶點。盡管在心臟疾病中發現大量circRNA發生表達變化，但迄今僅少數circRNA的作用和機制被初步揭示。因此，circRNA的作用和機制仍是目前的研究熱點，尤其是circRNA-m i RNA-m RNA調控網絡的構建將有助于深入了解疾病發生機制，發現新的防治靶點。對于circRNA的轉化醫學研究，中國科學院動物研究所王昆和李培峰等［31-33]發明了系列靶向線粒體分裂與凋亡相關circRNA、C H I F及M N C R等預防和治療心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病和心衰等疾病的新方法，有望將circRNA應用于臨床實踐。circRNA的研究和應用可能為多種心臟疾病的診斷和治療帶來革命性的改變。