間充質干細胞通過調控巨噬細胞極化減輕1型糖尿病模型小鼠炎癥反應

周 娜，劉偉江，李 蘋，3，孟祥宇，王 洋，王 鵬，樊 月，劉元林，李 雪，鄭榮秀，張 毅

（1.天津醫科大學總醫院兒科，天津 300052；2.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所，北京 100850；3.首都醫科大學附屬北京兒童醫院，北京 100045）

隨著現代生活水平的不斷提高，1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）患者呈不斷上升趨勢，已成為威脅青少年和兒童健康的主要代謝疾病之一。T1DM是一種自身免疫性疾病，多由T淋巴細胞介導，造成胰島β細胞破壞，使其喪失合成和分泌胰島素的功能，進而引起糖代謝紊亂［1]。目前，T1DM仍以胰島素治療為主，如果治療不及時則可能出現嚴重并發癥，影響患者的生活質量并危及生命［2]。因此，尋找最佳的治療方法是當今研究的熱點。近年來，間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）治療T1DM受到廣泛關注［3-4]。MSC是一種來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞［5-6]，具有低免疫原性和免疫調節等生物學功能［7-8]，可作用于多種免疫細胞，如T和B淋巴細胞為主的適應性免疫細胞及巨噬細胞、自然殺傷細胞和樹突狀細胞等固有免疫細胞［9-10]。目前已有研究表明，MSC通過改善T1DM的免疫紊亂狀態及保護殘存的β細胞，進而有效改善血糖狀態［11]。但具體機制仍不清楚。

巨噬細胞作為人體天然免疫的主要成員之一，可參與多種炎癥性疾病的發生發展［12]。在不同微環境下，可分化為作用相反的2個亞群，即經典活化M 1型和選擇性活化M 2型。M 1型巨噬細胞激活后可分泌促炎癥反應因子，如誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS），腫瘤壞死因子αα（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素1β（interleukin-1β，I L-1 β）和I L-1 2等；M 2型巨噬細胞活化后可促進抗炎因子I L-1 0和I L-4及轉化生長因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）分泌而抑制炎癥發生，精氨酸酶1（arginase-1，A r g-1）是其表達的主要分子之一［13-14]。現有研究已表明，M S C可調控巨噬細胞表型，促進其由促炎M 1型向抗炎M 2型極化，從而抑制炎癥反應，維持微環境的穩態［15-16]；且移植M S C可通過募集M 2型巨噬細胞使胰島β細胞增殖和再生，進而影響T1DM的病理生理過程［17-18]。但M S C是否通過調節巨噬細胞極化，從而減輕T1DM模型小鼠的炎癥反應仍不清楚。為此，本研究通過對T1DM模型小鼠進行M S C治療，進一步探討M S C調控巨噬細胞極化、減輕T1DM小鼠炎癥反應的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只6周齡雄性C 5 7 B L/6 J小鼠，體質量為1 8～2 1 g，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK-（京）2016-0006。在1 2 h晝夜交替下，飼養于軍事醫學研究院實驗動物中心；環境溫度保持在2 2～2 5℃，相對濕度為3 5%～5 0%。另5只1周齡雄性C57BL/6J小鼠（購自北京維通利華）用于M S C的分離培養。所有的動物實驗過程經院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試劑和主要儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、Trizol、油紅O、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素、β-磷酸甘油、維生素C磷酸鹽、丙酮酸和堿性磷酸酶購自美國Sigma公司；檸檬酸、檸檬酸鈉和1 0%中性甲醛購自國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白購自北京Solarbio科技有限公司；兔抗小鼠胰島素抗體（一抗）購自美國A b c a m公司；HRP-山羊抗兔I g G抗體（通用型，二抗）及D A B顯色劑購自丹麥DAKO公司；α-M E M、0.2 5%胰酶、PBS及胎牛血清購自美國Gibco公司；流式抗體（抗小鼠Ia，CD11b，Sca-1，CD105，CD34，CD45，CD31和C D 2 9抗體）購自美國ThermoFisher公司，APC-F4/80，PE-CD16/32和FITC-CD206抗體購自美國eBioscience公司；RTase M-MLV、RNA酶抑制劑及5×RTase M-MLV緩沖液購自日本TaKaRa公司；DTT、dNTP、無RNA酶水和2×Μltra Master Mix購自中國康為世紀有限公司；所用引物由安徽通用生物系統有限公司合成，引物序列見表1。

Tab.1 PCR primer sequence

穩擇易型血糖試紙和血糖儀購自美國強生公司；Qubit?2.0熒光定量儀、臺式低溫冷凍離心機、7500 Real Time System、常溫臺式離心機及細胞培養箱購自美國Thermo Fisher公司；流式細胞儀Facscalibur購自美國BD公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.3 骨實質來源MSC的分離培養和鑒定

在無菌條件下分離7日齡小鼠股骨及脛骨，用眼科鑷將骨碎片轉移至盛有1 mLⅡ型膠原酶的EP管中，37℃恒溫消化45 min后，將骨碎片轉移至含10%胎牛血清的α-MEM完全培養基中，采用骨片貼壁法培養小鼠骨片來源的MSC。傳至第3代（P3），采用流式細胞術、體外成脂及成骨誘導分化等方法鑒定分離培養MSC［8]。流式細胞儀檢測所用抗體為FITC-抗小鼠Ia，FITC-抗小鼠CD11b，FITC-抗小鼠 Sca-1，PE-抗小鼠CD105，FITC-抗小鼠CD34，FITC-抗小鼠CD45，PE-抗小鼠CD31及PE-抗小鼠CD29。同時將細胞接種6孔板，用含10%胎牛血清的α-MEM培養基進行成脂（地塞米松1 μmol·L-1，胰島素10 μg·L-1，IBMX 0.5 mmol·L-1和吲哚美辛 0.5 mmol·L-1）及成骨（地塞米松0.1 μmol·L-1，維生素C磷酸鹽50 μmol·L-1和β-磷酸甘油10 mmol·L-1）誘導分化，分別培養8和10 d，用油紅O染料工作液染色及實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測成脂分化關鍵轉錄因子CCAAT增強子結合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPα）和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ）mRNA表達。用堿性磷酸酶染料工作液染色及RT-PCR檢測成骨分化關鍵轉錄因子骨鈣素（osteocalcin）和Runt相關轉錄因子2（Runt related transcription factor 2，Runx2）mRNA表達。

1.4 1型糖尿病小鼠模型制備和MSC治療

所有小鼠適應性喂養2 d后隨機分為2組：正常對照組（n=10）和T1DM組（n=20）。正常對照組不做任何處理；T1DM組小鼠禁食12 h、禁水8～10 h后，ip給予含STZ 50 mg·kg-1檸檬酸鈉緩沖液，每日1次，連續5 d。第1次注射后，即刻恢復自由飲食；給藥第12天，連續3 d通過尾靜脈取血測隨機血糖，血糖平均值≥16.7 mmol·L-1即為建模成功。將建模成功的小鼠隨機分為T1DM模型組（n=10）和MSC治療組（n=10）。成模后第1和第15天，MSC治療組由尾靜脈注射MSC 5×105，正常對照組和T1DM模型組注射PBS；每周檢測小鼠隨機血糖和體質量。28 d后處死小鼠，用PBS反復灌洗腹腔，將灌洗液6000×g離心3 min，獲腹腔巨噬細胞；隨后取胰腺等組織待測。

1.5 胰腺組織HE染色和免疫組化檢測

胰腺組織取出后，立即置10%中性甲醛溶液中固定，采用H E染色檢測胰腺中胰島組織形態是否飽滿及胰島細胞分布是否均勻，以判斷病變程度［19]；采用免疫組化法檢測胰島素分泌水平及巨噬細胞（F 4/8 0）數量［18]。

1.6 實時熒光定量PCR法檢測腹腔巨噬細胞標志分子和炎癥因子mRNA表達

Trizol法提取腹腔巨噬細胞總RNA，取1μg RNA逆轉錄為c D N A；R T-P C R法檢測腹腔巨噬細胞標志分子（iNOS和A r g-1）及炎癥因子（I L-1 β，I L-4，I L-6，I L-1 0，I L-1 2，I F N-γ，T N F-α和T G F-β）m RNA表達。反應體系為cDNA1 μ L，P C R上下游引物（1 0 μ m o l·L-1）1 μL，q-P CRMaster Mix 1 0 μ L 和無RNA酶水8 μ L；反應條件為9 5℃ 10 min，（9 5℃ 15 s，60℃ 1 min）40個循環，95℃15s，60℃1min，95℃15s。GAPDH為內參基因，采用 2-△△Ct表示待測基因mRNA表達水平。

1.7 流式細胞術檢測腹腔巨噬細胞M1和M2表型

取腹腔巨噬細胞，加入流式抗體A P C-抗小鼠F 4/8 0，P E-抗小鼠C D 1 6/3 2及F I T C-抗小鼠C D 2 0 6抗體，避光孵育3 0 min；加入P B S 1 m L洗滌，4 5 0×g，離心5 min，棄上清，加入4%多聚甲醛2 0 0 μ L固定，上機檢測。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 骨實質來源MSC的鑒定

分離培養的MSC呈均一的纖維樣長梭形、旋渦狀貼壁生長（圖1A）。流式細胞儀檢測結果表明，細胞高表達Sca-1，CD29和CD105；不表達或低表達CD31，CD34，CD45，Ia和CD11b（圖1B）。油紅O染色結果顯示，分離培養的MSC成脂誘導后出現大量紅色脂滴（圖1C），且成脂關鍵轉錄因子CEBPα和PPARγ表達顯著增加（P＜0.01，圖1D）。成骨誘導后，堿性磷酸酶活性增加（圖1E），成骨關鍵轉錄因子骨鈣素和Runx2表達亦顯著增加（P＜0.01，圖1F）。上述結果提示，成功分離培養小鼠骨實質來源的MSC。

2.2 MSC治療對T1DM模型小鼠隨機血糖和體質量的影響

Fig.1 Pluripotency characteristics of mesenchymal stem cells（MSCs）derived from mouse compact bone. A：MSCs derived from murine compact bone were digested by collagenase and amplified to the passage 3（P3）in vitro. Cell morphologywas shown；B：expression status of surface molecules on MSCs was analyzed by flow cytometry；C：oil red O staining of adipocytesdifferentiated from MSCs；D：RT-PCR analyses of adipogenic markers in MSCs after adipogenic induction；E：alkaline phosphatasestaining of osteoblasts differentiated from MSCs；F：RT-PCR analyses of osteogenic markers in MSCs after osteogenic induction.n=3，＊＊P＜0.0 1，compared with corresponding control group.

與正常對照組比較，T1DM模型組小鼠隨機血糖顯著升高（P＜0.0 5）；與T1DM模型組相比，MSC治療組小鼠隨機血糖在治療7 d后逐漸下降，治療2 1 d后顯著降低（P＜0.0 5），2 8 d后降低（2 5.0±0.1）%（P＜0.0 5），但未降至正常對照組水平（P＜0.0 5）。與正常對照組相比，T1DM模型組小鼠體質量明顯降低（P＜0.0 5），M S C治療組體質量在治療后7 d內即開始增長，2 8 d后增加（1 2.0±0.4）（P＜0.0 5）（圖2）。

2.3 MSC治療對T1DM模型小鼠胰島素分泌和巨噬細胞數的影響

Fig.2 MSCs ameliorated non-fasting blood glucosed（A）and body mass（B）of streptozotocin（STZ）-induced type 1 diabetes mellitus（T1DM）model mice.T1DM was induced in male C57BL/6 mice using STZ 50 mg·kg-1intraperitoneal injection，5×105MSCs were injected into mice via tail vein injection route on the 1stday and the 15thday after incidence of diabetes.Blood glucose concentration exceeding 16.7 mmol·L-1in three consecutive daily measurements was considered diabetes.s，n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with T1DM model group.

HE染色結果顯示，T1DM模型組小鼠胰腺組織形態已完全被破壞，炎癥細胞浸潤明顯較多；MSC治療組胰腺組織形態較模型組改善，細胞分布大體均勻一致，炎癥細胞浸潤較少（圖3A）。免疫組化結果表明，T1DM模型組小鼠與正常對照組相比胰島素分泌顯著減少；與模型組相比，MSC治療組胰島素分泌增多（圖3B）；胰腺組織中F4/80陽性細胞數即巨噬細胞數量明顯增加（圖3C）。

2.4 MSC治療對T1DM模型小鼠腹腔巨噬細胞炎癥因子mRNA表達的影響

與正常對照組比較，T1DM模型組小鼠腹腔巨噬細胞促進炎癥因子 IL-1β，TNF-α，IL-6和 IL-12 mRNA表達顯著增加（P＜0.05），IFN-γ無明顯變化；抑制炎癥因子IL-4，IL-10和TGF-β表達則顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，MSC治療組炎癥因子IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-12 mRNA表達顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），抑制炎癥反應IL-4，IL-10和TGF-β mRNA表達顯著增加（P＜0.05）（圖4）。

2.5 MSC治療促進T1DM模型小鼠M2型巨噬細胞極化

由圖5所示，與正常對照組比較，T1DM模型組M1型巨噬細胞百分比升高到至（50.1±1.2）%（P＜0.05），其標志分子iNOS mRNA表達升高（P＜0.01）；M2型巨噬細胞百分比下降到（22.5±4.0）%，其標志分子Arg-1 mRNA表達下降（P＜0.05）；M2/M1比值降低（P＜0.05）。與T1DM模型組比較，MSC治療組M1型巨噬細胞百分比降低至（15.6±1.2）%，iNOS mRNA表達降低（P＜0.01）；M2型巨噬細胞百分比升高至（72.5±3.4）%，Arg-1 mRNA表達升高（P＜0.01）；M2/M1比值升高（P＜0.05）。

Fig.3 MSC treatment for 28 d decreased severity of insulitis and macrophage count in STZ-induced T1DM model mice.See Fig.2 for the mouse treatment.A：HE staining，the arrows show islet tissue；B：immunohistochemistry examination，the arrows show insulin secretion；C：immunohistochemistry examination，the arrows show the positive of F4/80.

Fig.4 MSC treatment up-regulated anti-inflammatory factors and down-regulated proinflammatory factors expression on peritoneal macrophages in STZ-induced T1DM model mice detected by RT-PCR.See Fig.2 for the mouse treatment.A：proinflammatory factors；B：anti-inflammatory factors，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with T1DM model group.

Fig.5 MSC treatment for 28 d promotes M2 macro?phage polarization in STZ-induced T1DM model mice.See Fig.2 for the mouse treatment.A：population of M1 cells；B：population of M2 cells；C：ratios of M2/M1；D：mRNA expression of iNOS on M1 cells；E：mRNA expression of Arg-1 on M2 cells.，n=10. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with T1DM model group.

3 討論

T1DM是青少年和兒童中常見的一種自身免疫性疾病，目前依舊是以胰島素治療為主，盡管隨著胰島素給藥方式的改進，已能改善患者的生活質量和身心健康［19]，但尚不能有效的降低其并發癥的發生率。目前研究發現，T1DM發病原因有很多，但主要病因是由于胰島β細胞進行性破壞，進而導致胰島素分泌不足和調節障礙。具體發病機制尚不清楚。但現有研究已證實，T1DM的發病機制涉及T細胞及多種固有免疫細胞如巨噬細胞等之間的相互調控，而這些免疫細胞數量的改變可造成胰島β細胞的損傷或減少［19-20]。因此，機體免疫紊亂狀態的糾正有望為T1DM的治療提供新的思路和靶點［22]。

MSC作為一種多能的成體干細胞，具有多向分化潛能、低免疫原性和免疫調節能力［23]，可作用于多種免疫細胞，如T及B淋巴細胞為主的適應性免疫細胞及巨噬細胞、自然殺傷細胞及樹突狀細胞等固有免疫細胞［9-10]。現有實驗研究已證實，MSC治療可改善T1DM的免疫紊亂狀態，但具體機制尚不清楚［24]。本研究發現，MSC治療組小鼠腹腔巨噬細胞的炎癥因子IL-1β，IL-6，IL-12和TNF-α mRNA表達下降，其中早期炎癥因子IFN-γ mRNA表達無明顯差異，而抑制炎癥反應的IL-10，IL-4及TGF-β mRNA表達顯著增加，提示MSC可通過巨噬細胞調節免疫，從而減輕糖尿病的炎癥反應。IFN-γ表達無明顯差異可能與檢測時間等相關，需進一步研究。

巨噬細胞作為人體一種重要的固有免疫細胞，在抗擊病原微生物及損傷修復等方面有重要作用，并能隨微環境的變化而向不同亞群（M1和M2）進行分化。其中M1型巨噬細胞有助于宿主防御外來微生物的侵襲，但持續活化可造成機體慢性炎癥的發生，此時若M2型巨噬細胞發生極化，可發揮抗炎的作用。但體內外實驗表明，機體M1型巨噬細胞不易向M2型巨噬細胞進行極化。目前已有研究發現，MSC移植能調節巨噬細胞的表型，促進其從促炎的M1型向抗炎的M2型極化，從而發揮抑制炎癥反應、維持微環境穩態的作用［15，26]。此外，也有動物實驗結果表明，給T1DM小鼠移植MSC，可募集M2巨噬細胞，促使胰島β細胞再生，以減輕糖尿病反應［27]。而巨噬細胞極化是否參與T1DM小鼠的炎癥反應過程仍不清楚。為此本研究制備了T1DM模型小鼠，用MSC移植治療，檢測體內腹腔巨噬細胞的M2/M1比值，RT-PCR檢測腹腔巨噬細胞相關炎癥因子mRNA表達。結果顯示，MSC治療組小鼠的血糖、體質量等生理指標均優于T1DM模型組。HE染色和免疫組化結果也顯示，MSC治療組胰島損傷程度均優于模型組，說明MSC可治療小鼠的T1DM。流式細胞術結果表明，MSC組M2/M1型巨噬細胞的比值顯著高于T1DM模型組；RT-PCR比較分析兩組小鼠腹腔巨噬細胞中M1和M2型巨噬細胞相關基因的表達水平。結果表明，相較于T1DM模型組，MSC治療組M2型巨噬細胞相關基因Arg-1表達水平顯著上升，M1型巨噬細胞相關基因iNOS表達水平顯著下降。據報道，MSC免疫調節具有可塑性，其在T1DM模型小鼠中如何促進M2型巨噬細胞極化，以及糖尿病炎癥微環境如何誘發MSC調節固有免疫細胞的炎癥反應，仍需進一步探究。IL-1β作為固有免疫反應的重要因子，不僅可介導炎癥反應，也可參與細胞凋亡過程；MSC治療T1DM后IL-β分泌減少，同時可能抑制了其誘發凋亡反應，仍需深入研究，這也對MSC治療T1DM疾病提供了新的研究方向。

綜上所述，MSC移植可減輕T1DM模型小鼠的炎癥反應，其機制可能與調控MI和M2巨噬細胞極化有關，MSC促進M2型巨噬細胞增多，抑制M1型巨噬細胞在小鼠T1DM模型中產生的炎癥反應，從而減輕T1DM的發展。本研究為MSC治療T1DM提供了新的理論依據，為深入了解MSC治療T1DM的機制及臨床應用提供有益參考。