水稻OsENO2-2基因過表達對水稻抽穗期的影響

劉小云 李曉 李騰飛 蘇魯方

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水稻基因過表達對水稻抽穗期的影響

劉小云 李曉 李騰飛 蘇魯方

(江漢大學 交叉學科研究院, 武漢 430056; E-mail: lxytcw@webmail.hzau.edu.cn)

是通過可變剪切產生的短轉錄本，其cDNA序列從粳稻中花11中分離獲得。本研究的主要目的是初步分析在水稻抽穗期調控中的作用。構建了的超量表達載體，獲得轉基因植株，通過對表型的觀察和統計，分析目的基因在過量表達條件下的功能，并利用反向遺傳學方法驗證該基因的功能。過量表達導致水稻在長日照條件下的抽穗期推遲，而短日照條件下抽穗期無明顯變化。通過qRT-PCR方法對水稻開花關鍵基因的檢測發現，在長日照條件下，的表達量在超表達材料中顯著下調，其他開花重要基因表達量在野生型和超表達材料中沒有顯著變化；而在短日照條件下，所有檢測基因的表達量在野生型和超表達材料中均沒有顯著變化。在長日照條件下，主要通過調控基因的表達來調控水稻抽穗期。

水稻; 過量表達;;烯醇化酶基因;抽穗期

水稻抽穗期與產量密切相關，抽穗期調控基因直接或間接地影響水稻株高、穗數、一次枝梗數及二次枝梗數等農藝性狀。因為較長的生育期往往伴隨著更高的株高和更多的分蘗，所以在作物產量的研究中，經常把長生育期和高產聯系在一起[1]。

光周期途徑是水稻抽穗期調控的主要途徑。水稻是短日照植物即長夜植物。目前已知水稻光周期調控主要由兩條途徑調控，一條是途徑，另一條是不依賴的光誘導途徑即途徑。其中途徑與擬南芥途徑類似，受光照和節律鐘調控[2-5]，是水稻中與擬南芥()同源的基因，它在調控水稻抽穗的過程中有著雙重作用，在短日照條件下促進抽穗而在長日照條件下抑制水稻抽穗[6]。()是水稻中與擬南芥()同源的成花素基因，促進成花轉變[7]。()在短日照條件下促進的表達，但是在長日照條件下，由光敏色素B轉換為的阻抑物抑制的表達[8]。因此，在短日照條件下有較高的表達量而在長日照條件下表達量較低。是的同源基因，主要調控長日照條件下的成花轉變[9]。同時的表達受到水稻抽穗節律鐘中的關鍵基因()的正向調控[10]。另一條途徑是不依賴的光誘導途徑即途徑，該途徑是水稻中特有的。()是受短日照促開花因子調控的B型反應調節子，它可以促進、和的表達，是短日照抽穗調控的正調控因子[11]。在短日照條件下，和同時被正調控。而在長日照條件下則被正調控，被()負調控[1]，是一個具有CCT結構域的轉錄因子，是長日照條件下的抽穗抑制子[12]。在長日照和短日照條件下，均可被//正調控[13-14]，促進和的表達從而促進和的表達，最終促進水稻抽穗[15]，是位于光周期途徑較下游的促開花因子[16,17]。

烯醇化酶(enolase, ENO)是糖酵解中的關鍵酶之一，催化2-磷酸甘油酸形成高能化合物磷酸式丙酮酸，在細胞能量代謝中起重要作用。烯醇化酶基因在原核生物中研究較多，除去催化作用外，還在原核生物入侵動植物過程中有重要作用，在動物中也參與轉錄、凋亡調控以及細胞分化過程[18, 19]。在擬南芥中編碼該酶的基因為，其可變剪切體基因在超表達后對開花期有影響，并且在逆境響應中也有重要作用[20,21]。

本研究通過構建轉基因材料研究對抽穗期的調控作用，揭示該基因在水稻高產育種中可能存在的應用價值。

A–超表達載體結構。LB為T-DNA左邊界；Hn–潮霉素抗性篩選標記；Pubiqutin為玉米ubiqutin基因啟動子；GUS為β-葡萄糖苷酸酶基因；RB為T-DNA右邊界。B–RNAi載體結構。35S–花椰菜花葉病毒啟動子；R-f為OsENO2-2 RNAi片段。

Fig. 1. Construction of overexpression vector and RNAi vector.

1 材料與方法

1.1 植物材料與菌株

粳稻中花11(野生型)、超表達轉基因株系的T1和T2代植株、RNAi抑制轉基因株系的T1和T2植株均種植于華中農業大學作物遺傳改良國家重點實驗室試驗地。田間常規管理。

所用菌株為大腸桿菌()菌株DH5α和根癌農桿菌()菌株EHA105，均由本實驗室保存。

1.2 OsENO2-2基因全長和RNAi片段的擴增

利用Trizol抽提試劑盒(Invitrogen公司)抽提中花11幼苗葉片的RNA，逆轉錄成cDNA(逆轉錄試劑盒, Bio-Rad公司)。根據RGAP數據庫(http://rice. plantbiology.msu.edu/)里(Os06g04510.2)的cDNA序列，設計基因全長引物(-F和-R，兩端加上Ⅰ酶切位點，圖1-A)和RNAi片段引物(R--F和R--R，兩端分別加Ⅰ、Ⅰ和Ⅰ、HⅠ酶切位點，圖1-B，表1)。以上述cDNA為模板進行PCR擴增，PCR條件如下：94℃下4 min; 94℃下30 s，60℃下30 s，72℃下60 s，循環35次; 72℃下延伸7 min，4℃下保存。將擴增出的全長連接到T/A克隆載體(pGEMT-vector，Promega公司)上，用T7和SP6引物測序驗證。

表1 本研究所用引物

1.3 OsENO2-2過表達載體和RNAi載體的構建

將帶有片段的T/A克隆用Ⅰ單酶切，回收目標條帶，與Ⅰ單酶切的表達載體質粒pU1301連接，pU1301是在國際上常用的植物遺傳轉化載體pCAMBIA1301[22]基礎上改造的，是攜帶具有組成型和超量表達特征的玉米泛素啟動子的農桿菌介導的遺傳轉化載體。pCAMBIA1301載體由澳大利亞CAMBIA實驗室惠贈。內切酶Ⅰ和連接所使用的T4連接酶均購自寶生物工程大連有限公司。將連接產物導入到DH5α細胞中，菌液經PCR檢測呈陽性后送至測序。將測序正確的pU1301-OsENO2-2質粒電擊到EHA105，菌液檢測呈陽性者作為遺傳轉化菌株。

用Ⅰ和HⅠ酶切帶有RNAi片段的T/A克隆，回收目標條帶，與Ⅰ和HⅠ酶切的表達載體質粒pDS1301連接獲得pDS1301-1載體(所使用的內切酶均購自寶生物工程大連有限公司，連接酶為上海英俊生物技術公司產品)；再將帶有RNAi片段的T/A克隆載體＋pDS1301-1載體用Ⅰ和Ⅰ酶切，回收目標條帶，與Ⅰ和Ⅰ酶切的質粒pDS1301-1連接，得到RNAi抑制載體pDS1301-2。

A–OsENO2-2全長開放閱讀框的PCR擴增。B–過表達載體的酶切鑒定。1~4為4個不同單克隆，其中1、3、4為陽性克隆；2–陰性對照；M為DNA標記。

Fig. 2. PCR amplification ofand identification of recombinant plasmid.

1.4 農桿菌介導的水稻遺傳轉化

利用農桿菌介導的遺傳轉化方法將全長以及RNAi片段轉入到水稻基因組中，培養基以及使用的試劑主要參照華中農業大學授權專利(專利號ZL200710053552.9)。并用空載體產生轉基因植株作對照。

1.5 轉基因植株的DNA檢測

用CTAB法[23]從葉片中提取基因組DNA，用載體中的潮霉素抗性基因()對獲得的過表達轉基因植株進行PCR檢測。所用引物為-F和-R，引物序列如表1所示。反應條件如下: 94℃下４min；94℃下30 s，57℃下30 s，72℃下30 s，30次循環；之后72℃下延伸5 min。通過PCR篩選出陽性株系。

1.6 OsENO2-2在野生型材料不同組織的特異性表達分析以及轉基因植株中的表達分析

為了檢測目的基因在野生型材料不同組織的特異性表達量以及在超表達植株中目標基因的表達量，采用實時PCR的方法進行了表達分析。實驗所用的總RNA分別來自來中花11的幼苗，抽穗期的倒2葉、劍葉、葉鞘、莖稈、根、幼穗和胚乳以及轉基因材料分蘗期的水稻葉片，采用Trizol抽提試劑盒(Invitrogen公司)抽提RNA，逆轉錄成cDNA(Bio-Rad公司逆轉錄試劑盒)，用實時熒光定量PCR檢測表達量(試劑購自寶生物工程大連有限公司，儀器為美國ABI公司7500 PCR儀)，PCR參數為95℃下預變性10 s；95℃下變性5 s，60℃下退火延伸40 s，45個循環。以內源為參照基因，對目的基因在不同組織中特異性表達量進行相對定量分析；轉基因受體材料中花11為參照樣本，對在轉基因植株葉片中的表達進行相對定量分析。用2法[24]計算基因表達的相對變化，實驗設置3次技術重復。實時PCR所用引物序列為：-QF和-QR，-QF和-QR(序列見表1)。

1.7 光周期材料的處理及目的基因的表達量分析

將轉基因植株和野生型植株分別在長日照條件(14 h光照30℃/10 h黑暗28℃)下培養6周，在短日照條件(10 h光照30℃/14 h黑暗28℃)下培養8周后，每4 h取一次樣，取樣部位為植株頂端3葉，抽提葉片RNA，反轉錄產物檢測抽穗相關基因的表達量。取葉片總RNA，逆轉錄成cDNA，用實時熒光定量PCR的方法檢測抽穗相關基因的表達量(PCR同1.6，所用引物列于表1，引物名稱含QF或QR)。以內源為參照基因，用2法[24]計算基因表達的相對變化，設置3次重復。

2 結果與分析

2.1 OsENO2-2克隆與超量表達載體和RNAi載體的構建

用RT-PCR方法從水稻葉片中獲得基因的全長ORF，目的片段長度與RGAP數據庫公布的片段長度1062 bp吻合，符合預期設計(圖2-A)。將該片段連接到T/A載體上，通過測序分析目的片段序列，并與網站中序列進行比對驗證。隨后，用Ⅰ將連接有外源的T/A載體和pU1301載體分別進行單酶切后連接，轉化大腸桿菌后，經過PCR檢測以及酶切檢測，得到預期大小片段(圖2-B)，表明目的片段已成功連入空載體中，獲得最終的過表達載體。同樣，用RT-PCR從葉片中獲得基因的RNAi片段，利用酶切方法構建RNAi載體。將構建成功的重組質粒進行測序驗證后，轉化到農桿菌EHA105中，用于后續的轉基因實驗。

2.2 OsENO2-2基因的組織特異性表達分析

為了確定在不同組織材料中的表達量，分別提取中花11的幼苗，抽穗期的倒2葉、劍葉、葉鞘、莖稈、根、幼穗和胚乳的總RNA，反轉錄成cDNA，通過實時PCR方法進行表達量檢測。檢測結果顯示，在水稻各個部位均有表達，但不同組織部位表達差異顯著，在葉片中表達量顯著高于其他部位，尤其是劍葉中表達量最高，而幼穗、胚乳中表達量最低(圖3)。

2.3 轉基因株系的DNA檢測和OsENO2-2在轉基因植株中的表達分析

通過農桿菌介導的遺傳轉化[26]將pU1301載體和pU1301空載體以及pDS1301-2載體導入野生型中花11中，抽提DNA通過PCR檢測載體上抗性基因后，最終共獲得50個T0轉基因陽性株系，其中pU1301載體轉化后陽性株系(超表達陽性株系)有18個，pU1301空載體轉化后陽性株系(陰性對照株系)有16個，pDS1301-2載體轉化后陽性株系15個(圖4-A)。共選取15個轉基因陽性株系包括7個超表達陽性株系(OX-1，OX-2，OX-3，OX-4，OX-5，OX-6，OX-8)、1個超表達陰性對照株系(OX-7)和7個RNAi株系(R-1，R-2，R-3，R-4，R-5，R-6，R-7)種植到大田里，獲得了T1代轉基因株系，通過實時PCR方法檢測轉基因中目的基因的表達，發現7個超表達陽性株系(OX-1，OX-2，OX-3，OX-4，OX-5，OX-6，OX-8)中的表達量明顯增強，與野生型相比，的表達量上升3~15倍。陰性對照株系OX-7中基因的表達量與野生型相比沒有明顯差異(圖4-B)。7個RNAi株系(R-1，R-2，R-3，R-4，R-5，R-6，R-7)中除了R-5表達量與野生型無顯著差異外，其他株系目的基因表達量均顯著降低，其中R-1和R-7中的表達量下降約4倍，R-6中下降約3倍，R-2、R-3和R-4中目的基因下降約2倍(圖4-B)。上述結果表明構建的過表達載體和RNAi載體能夠正常工作，超表達以及抑制效果均良好。

S–幼苗；FL–劍葉；L–抽穗期倒2葉；LS–葉鞘；ST–莖稈；R–根；PA–幼穗；EN–胚乳。

Fig. 3. Tissue-specific expression of

A–轉基因陽性植株Hn基因PCR鑒定，自上到下依次為超表達載體、空載體對照組、RNAi載體的轉基因植株。B–轉基因植株OsENO2-2的表達量(平均值±標準差)。WT–野生型；OX-1~OX-8，8個超表達轉基因植株；R-1~R-7，7個RNAi轉基因植株。

Fig. 4. PCR analysis ofgene in T0transgenic positive plants and expression analysis ofin transgenic lines.

A–野生型和超表達植株的抽穗期表型。WT–野生型植株，OX–超表達植株; B–野生型和超表達植株在長日照大田的抽穗期(n=30)。WT–野生型植株，OX-1, OX-2, OX-3為超表達陽性株系，OX-7為轉基因對照株系。LD–長日照條件。C–在長日照條件下(光照14 h/黑暗10 h)超表達，RNAi株系以及野生型株系的抽穗期(n=10)。R-1，R-2，R-5為RNAi抑制陽性株系。D–在短日照條件下(光照10 h/黑暗14 h)超表達，RNAi株系以及野生型株系的抽穗期(n=10)。SD–短日照條件。**表示與野生型植株相比差異達極顯著水平(P<0.01，t檢驗)。

Fig. 5. Heading date of the transgenic plants(Mean±).

2.4 轉基因植株的表型分析

將上述8個超表達轉基因株系的T2代植株種植到大田(武漢6月中旬－8月中旬屬于長日照時間)，觀察統計表型時發現，7個轉基因株系的植株抽穗期較野生型顯著推遲(圖5-A)，1個陰性株系植株與野生型相比沒有差異。選取4個株系，分別取30株植株進行統計分析，其中3個超量表達株系的抽穗期顯著推遲，1個陰性對照株系與野生型無明顯變化(圖5-B)。根據3個株系的表達量以及相應抽穗期分析得知，轉基因植株的抽穗期推遲是由于的過量表達所致。隨后，我們選取大田種植的這3個株系在培養箱中進行嚴格日照條件控制，分別取10株植株進行統計分析，結果顯示在長日照條件下2個超量表達的株系抽穗期較野生型顯著推遲，1個陰性對照株系與野生型相比無顯著變化(圖5-C)；短日照條件下，3個株系與野生型相比均無顯著差異(圖5-D)。

將7個RNAi抑制轉基因株系的T2植株種植到大田(武漢6月中旬－8月中旬屬于長日照時間)，并未發現抽穗期與野生型有差異。在嚴格控制長短日照條件的培養箱中種植R-1、R-2和R-7株系，不管是長日照還是短日照條件下，抽穗期與野生型相比均無顯著變化(圖5-C、D)。

2.5 OsENO2-2基因在不同光周期條件下晝夜節律性表達

由于超表達植株抽穗期推遲，推測表達可能與光周期有關。在長、短日照條件下檢測野生型和超表達植株中的相對表達量，結果表明野生型植株的基因在長、短日照條件下均有節律性表達，并且在長日照條件下表達量顯著高于短日照條件下(圖6)。不管是在長日照條件還是短日照條件下，在光照條件下表達量較高，進入黑暗條件后表達量降到最低(圖6)。在超表達OX-2株系純合植株中，在長、短日照條件下的任何時間點均較野生型超量表達。

2.6 轉基因植株中抽穗相關基因的表達量檢測

根據表型統計分析的結果，在長日照條件下過量表達導致抽穗推遲。為了研究基因在水稻抽穗過程中的功能，將轉基因植株(OX-2株系純合植株)和野生型植株分別在長日照條件下和短日照條件下處理后，反轉錄產物檢測抽穗相關的關鍵基因的表達量。qPCR檢測結果顯示，在長日照條件下，的表達量在超表達材料中顯著下調，下游基因和也相應顯著下調表達，而其他抽穗相關基因、、、、表達量在野生型和超表達材料中基本沒有變化(圖7)；而水稻在短日照條件下，、、、、、以及的表達量在野生型和超表達材料中均沒有顯著變化(圖8)。

LD–長日照條件(光照14 h/黑暗10 h); SD–短日照條件(光照10 h/黑暗14 h); WT–野生型植株; OX–OsENO2-2超表達植株。

Fig. 6. Circadian rhythm expression ofunder different photoperiods(Mean±).

3 討論

近年來，調控水稻抽穗期的光周期途徑中的關鍵基因被克隆和鑒定，這些基因在短日照促進水稻抽穗途徑、長日照抑制水稻抽穗途徑和長日照誘導水稻成花途徑中發揮著重要的作用。研究報道表明，和分別在長日照和短日照下對水稻成花轉換起到主導作用，而在短日照條件下表達量高，長日照條件下表達量低，表明在短日照條件下，主要由調控來調控水稻抽穗期，是在不表達的情況下在短日照下起作用；長日照條件下主要由正調控水稻抽穗期[9]，而目前研究比較清楚的是作為的上游調控因子來調節水稻抽穗期，而在長日照條件下表達量低，那么在長日照條件下作為的上游調控因子可能作用有限，也就是說還有可能通過其他上游調控因子來調控其表達來影響水稻長日照條件下抽穗期。而我們的研究發現基因正是在長日照條件下作為RFT1的上游正調控因子來調節水稻抽穗(圖9)。因此，我們的研究結果是對于水稻長日照條件下抽穗調控機理的補充。至于基因是否是直接影響的表達以及調控的表達的機制目前尚不清楚還有待研究。

另一方面，我們在研究中發現基因僅在超量表達的情況下對水稻長日照條件下正常抽穗有顯著影響，基因被抑制后并未觀察到水稻抽穗表型的變化。這一結論表明在水稻中可能存在基因的同源基因，并在部分功能上與存在冗余的作用，當的表達量顯著降低時，有其他基因來互補它的功能，使植物的生理狀態不受影響進而保證植株能夠正常生長發育。

植物的代謝調節是植物適應不同環境保證植物正常生長的機制之一，例如植物糖酵解是由不同的生物和非生物脅迫引起的，如病原體攻擊、氧化應激和缺氧等。在受到脅迫條件的植物中，增加糖酵解對于抵抗逆境提供額外的能量和活性氧清除劑(如丙酮酸和NADH)是非常重要的。烯醇酶是糖酵解途徑中的關鍵酶之一，烯醇酶活性直接影響糖酵解的進程，因此編碼烯醇酶的基因在植物中的功能也是非常重要的。是擬南芥中烯醇酶基因的同源基因，它有可能影響水稻中烯醇酶的活性從而與水稻的代謝過程息息相關。那么，水稻的代謝與抽穗過程中間是否存在一定的聯系也有待進一步研究。

此外，我們的研究還發現，基因在超表達后，不僅水稻抽穗時間顯著推遲，而且轉基因植株的種子的形態也發生了顯著改變，種子的胚乳顯著增大，千粒重顯著增多。這些性狀的變化也表明，水稻的抽穗時間與水稻產量之間是存在著一定的關系的，水稻抽穗時間推遲，營養生長時期延長，營養物質積累多，導致種子的營養物質也積累多從而使種子增大，但其中的分子機制目前也并不清楚，還在研究中。

Fig. 7. Expression levels of key heading regulatory genes in leaves ofoverexpression plants(OX) compared to wild type(WT) under long-day condition(Mean±).

Fig. 8. Expression levels of key heading regulatory genes in leaves ofoverexpression plants(OX) compared to wild type(WT) under short-day condition(Mean±).

圖9 OsENO2-2基因在水稻長日照條件下調控開花途徑中的作用

Fig. 9. Summary offunction in LD pathways of rice flowering control.

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Overexpression ofAffects Heading Date in Rice

LIU Xiaoyun, LI Xiao, LI Tengfei, SU Lufang

(Interdisciplinary Research Institute, Jianghan University, Wuhan 430056, China; E-mail: lxytcw@webmail.hzau.edu.cn)

was isolated fromcultivar Zhonghua 11as a short transcript produced by alternative splicing ofwhich is homologous to. To reveal the function of,we constructed an overexpression vector ofand obtained the transgenetic plants. Based on the observation and statistics of phenotype in overexpressed plant and wild-type, we validated the function ofusing reverse genetics method.Overexpression oftransgenetic plants delayed heading date only under long-day conditions but not short-day conditions. qRT-PCRexpressionanalysis of the critical flowering time genes showedthat in long-day conditions, the expression ofin overexpressed plants was downregulated, and the expression levels of the other tested genes did not change significantly in wild-type and overexpressed plants; but in short-day conditions, the expression of all the tested genes in wild-type and over-expression plants did not change significantly.mightbeinvolvedinthephotoperiodicpathwaystoregulatetheheading dateinriceby regulating the expression ofgene.

rice; overexpression;; enolase gene; heading date

10.16819/j.1001-7216.2018.7055

Q786; S511.032

A

1001-7216(2018)01-0012-11

2017-05-18；

2017-09-15。

國家自然科學基金資助項目(31600981)；江漢大學科研啟動項目(1019-06210002)。