河南省雞源糞腸球菌的分離鑒定與耐藥性分析

朱雷，李金磊，董鵬，狄元冉，鞏丹，張增波

（河南省獸藥飼料監察所，河南 鄭州 450008）

腸球菌原屬于鏈球菌屬，1994年正式被獨立為腸球菌屬[1]。糞腸球菌是一種革蘭氏陽性菌，廣泛分布于自然界中，常棲居于人和動物的腸道中，在畜牧業中糞腸球菌常作為益生菌飼料添加劑來調節畜禽腸道菌群，是重要的條件致病菌[2]。近年來，隨著抗菌藥物和免疫制劑的廣泛使用和侵入性治療機會的增加，使得糞腸球菌成為醫院感染的重要病原菌之一[3]，我國醫院分離的病原菌中，糞腸球菌位居前3位[4]。在獸醫臨床研究中，由腸球菌引起的動物疾病也日益增多[5],豬和雞感染糞腸球菌發病以及死亡的報道也越來越多[6-7]。據研究顯示，多重耐藥性在腸球菌中已普遍存在，并且變得日益嚴重[8]，這給人畜臨床抗感染治療帶來極大的挑戰。作為可以衡量抗菌藥物耐藥性水平的革蘭氏陽性指示菌，對雞源糞腸球菌的耐藥性分析和研究是極其重要的，可以為科學制定抗菌感染防治方案以及細菌耐藥性監測提供必要的理論依據。該試驗從河南省A、B、C、D4個地區的規模化養雞場抽取樣品進行糞腸球菌分離、鑒定，隨后進行耐藥性試驗，以期掌握河南省雞源糞腸球菌的耐藥情況，為以后的臨床用藥和糞腸球菌的控制預防提供科學指導依據。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

1.1.1 菌株

腸球菌標準菌株ATCC 29212，購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.2 樣品來源

2016年1月至12月抽取河南省A、B、C、D4個地區規模化雞場肛門拭子樣品180批。

1.1.3 培養基與試劑

革蘭氏陽性細菌鑒定板、一次性無菌采樣棒（BHI）、K-F鏈球菌瓊脂、營養瓊脂、腦心浸液瓊脂、革蘭氏陽性細菌藥敏板。

1.1.4 儀器設備

低溫可疊放搖床、細菌濁度儀、全自動細菌鑒定/藥敏系統、梯度PCR儀、凝膠成像系統。

1.1.5 引物

糞腸球菌引物P1：5'-ACTTATGTGACTAAC TTAACC-3'，P2：5'-TAATGGTGAATCTTGGTTTGG-3'，擴增片段長度為326bp。

1.2 方法

1.2.1 預增菌

將一次性無菌采樣棒采集的樣品盡快送到實驗室，37℃培養16～20h，同時設陽性和陰性對照。1.2.2 樣品的分離、純化

取預增菌菌液1～2環，劃線于K-F鏈球菌瓊脂上，37℃培養（48±2）h，選取單個典型菌落進行純化，最后將純化好的菌落劃線接種于腦心浸液瓊脂培養基。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 PCR鑒定 用滅菌棉簽挑取純化好的菌落，加入裝有無菌生理鹽水的1.5ml離心管中，反復冷凍煮沸2～3次，12000rpm離心取上清液作為PCR擴增模板。同時設陽性對照、陰性對照和空白對照。

50μl總反應體系為：預混酶 25μl ddH2O 18μl P1 1μl P2 1μl模板 5μl

反應條件為：95℃預變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃后延伸5min；4℃保存。同時設置陽性對照、陰性對照和空白對照。

PCR結束后，取8μlPCR產物，用1.5%瓊脂糖進行電泳，15V/cm電泳20～30min，凝膠成像系統觀察結果。

1.2.3.2 鑒定系統鑒定 對PCR鑒定為糞腸球菌陽性的

樣品，采用全自動細菌鑒定/藥敏系統進一步鑒定。

1.2.4 藥敏試驗

取營養瓊脂上經鑒定的糞腸球菌菌落，用生理鹽水調制0.5MCF，吸取10μl加入到10ml肉湯中，然后分別取100μl加入到96孔藥敏板中，37℃培養16～20h，讀取藥敏試驗結果。

2 結果

2.1 菌株分離結果

經預增菌培養，KF鏈球菌瓊脂分離純化，最后經PCR及全自動細菌鑒定/藥敏系統鑒定，河南地區規模化雞場共分離糞腸球菌100株，分離率為55.6%，其中A、B、C、D4個地區分離率分別為70.00%（21/30）、38.90%（35/90）、90.00%（27/30）、56.70%（17/30）。具體情況見表1。

表1 2016年河南省各地區雞源場糞腸球菌分離情況

2.2 藥敏試驗結果

分離的100株糞腸球菌對克林霉素、泰妙菌素、青霉素、頭孢西丁、磺胺異惡唑、替米考星、紅霉素耐藥較嚴重，耐藥率分別為100.00%、100.00%、100.00%、98.81%、97.62%、94.05%、92.86%；對頭孢噻呋、強力霉素（多西環素）、氧氟沙星耐藥相對嚴重，耐藥率均在60%～90%；對萬古霉素全部敏感。

2.3 不同地區耐藥結果

不同地區耐藥結果存在差異，A地區耐藥率較其他地區偏高，A、C地區對強力霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、復方新諾明的耐藥率明顯高于B、D地區，D地區對頭孢噻呋的耐藥率明顯低于A、B、C地區，A、B地區對慶大霉素的耐藥率明顯高于C、D地區。具體結果見表2。

表2 河南省2016年不同地區雞源糞腸球菌耐藥情況

3 討論

糞腸球菌很易被誘導產生新的耐藥性，并且對許多抗菌藥物可以產生獲得性耐藥，如對高水平的氨基糖苷、糖肽類(萬古霉素)、β-內酰胺、紅霉素、四環素、利福平等，耐藥菌株的感染使常規性治療難以奏效[9]。

該研究通過對河南省規模化雞場的糞腸球菌進行分離純化、鑒定以及耐藥性試驗，共分離糞腸球菌100株，分離率55.60%，與黃雁[10]等研究的福建某雞場的糞腸球菌分離率為77.80%相比，相對較低，比蘇崴藝[11]等從遼寧省雞場分離率為24.00%要高。這種分離率存在差異，可能是由地區不同、采樣時間不同導致的，也可能是不同養殖場環境差異及用藥情況不同所致。

分離的100株糞腸球菌對克林霉素、泰妙菌素、青霉素、頭孢西丁、磺胺異惡唑、替米考星、紅霉素耐藥較嚴重，耐藥率均超過90.00%；對頭孢噻呋、強力霉素（多西環素）、氧氟沙星耐藥相對嚴重，未發現耐萬古霉素菌株。這一結果比張慧[12]等研究的雞源糞腸球菌對紅霉素、慶大霉素的耐藥率分別為90.00%和23.70%略高（該試驗結果分別為92.86%和36.90%）；比商軍[13]等研究的雞源糞腸球菌對青霉素、紅霉素、慶大霉素的耐藥率分別為91.30%、91.30%和26.10%略高，（該試驗結果分別為100.00%、92.86%和36.90%）。這種耐藥率的差異，表明不同動物來源其耐藥率存在差異，不同地區、不同養殖環境、不同用藥情況均可導致其耐藥率不同。

從該次試驗結果看，河南省雞源性糞腸球菌耐藥現象已相對較為嚴重，在今后的管理過程中，應引導養殖企業規范用藥，合理用藥，營造更好的養殖環境，進一步控制動物源細菌耐藥性的產生。

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[3]孟憲祥，曹延忠，郭麗.5年腸球菌分布及耐藥性變遷分析[J].醫學檢驗與臨床，2012，23（3）：37-38．

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[11]蘇崴藝，李欣南，韓鐫竹.某養殖場雞源糞腸球菌分離鑒定及耐藥性研究[J].現代畜牧獸醫，2014，（4）：48-50．

[12]張慧，葉丹娟，何晴，等.人和雞來源糞腸球菌耐藥性以及毒力基因分布研究[J].現代預防醫學，2014，41（14）：2611-2714．

[13]商軍，顧欣，張文剛，等.豬、雞源分離糞腸球菌的核糖體分型及耐藥性分析[J].中國抗生素雜志，2017，42（3）：230-236．