糞樣保存方法對黑白仰鼻猴腸道結節線蟲監測的影響

李延鵬，黃志旁，劉碩然，楊毅梅，鐘 泰，蘇錫鈞 ，崔亮偉，肖 文*

（1.大理大學東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；2.云南省中國三江并流區域生物多樣性協同創新中心，云南大理 671003；3.白馬雪山國家自然保護區管理局，云南迪慶 674609；4.西南林業大學，昆明 650224）

寄生蟲病是危害人類、牲畜和家禽健康的主要疾病之一〔1-2〕。在占世界總人口數量77%以上的廣大發展中國家，特別是在熱帶和亞熱帶地區的發展中國家寄生蟲病廣泛流行，威脅著兒童和成人的健康和生命〔3-4〕。因此，寄生蟲病的危害仍是普遍存在的公共衛生問題〔5〕。作為發展中國家的人口大國，中國幅員遼闊，地跨寒、溫、熱三帶，自然條件差別很大，人民生活習慣復雜多樣，使我國成為寄生蟲病嚴重流行的國家之一，特別是在廣大農村，寄生蟲病一直是危害人民健康的常見疾病。瘧疾、血吸蟲病、絲蟲病、黑熱病和鉤蟲病，曾被稱為“五大寄生蟲病”，奪去過成千上萬人的生命，嚴重阻礙農業生產和經濟發展〔5〕。

從糞便中檢出寄生蟲蟲卵，是診斷腸道寄生蟲病的常用方法〔6-7〕，但是寄生蟲蟲卵的發育時間較短，故其鏡檢時都要求使用新鮮糞便樣品〔8〕。在人體寄生蟲檢測時糞便樣品可及時獲得，但是對于野生動物而言，在檢測時及時獲得糞便樣品就存在較大難度，甚至是不可能實現的。為了保持糞便樣品中的原蟲形態及抑制蟲卵的發育，應立即對糞便進行固定保存。在寄生蟲診斷醫學中，有多種的糞便樣品保存方法，最常用保存方法可分為利用保存劑進行保存和低溫保存兩種，常用的保存劑有福爾馬林、硫柳汞-碘-甲醛溶液（MIF）、肖氏固定液（Schaudinn's fluid）和聚乙烯醇〔9-11〕，低溫保存主要是冷凍保存。

針對野生動物的寄生蟲研究，其主要介質為血液、組織或糞便樣品〔12〕，而針對活體的野生動物而言血液和組織樣品是很難獲得的，因此活體野生動物的研究往往只能依托糞便介質進行。但目前尚沒有針對野生動物糞便寄生蟲檢測的糞便樣品保存方法比較研究的報道，為此本文針對白馬雪山國家級自然保護區黑白仰鼻猴的寄生蟲感染現狀，進行了糞便中結節線蟲（Oesophagostomumsp.）檢測樣品的保存方法對比研究。

1 實驗材料與方法

1.1 研究地點研究地點位于云南省西北部的白馬雪山國家級自然保護區境內。白馬雪山國家級自然保護區在行政區上，地跨德欽縣的升平鎮、奔子欄鎮、霞若鄉和維西縣的巴迪鄉、葉枝鄉、康普鄉、白濟訊鄉、攀天閣鄉和塔城鎮。地處北緯27°24＇～28°36＇，東經98°57＇～99°25＇之間，屬橫斷山脈東部云嶺的一部分，是“三江（金沙江、瀾滄江、怒江）并流”地區，也是青藏高原向云貴高原的過渡地帶，自然地理環境極為復雜。見圖1。

圖1 研究地點

1.2 實驗材料福爾馬林保存液：在100 mL的甲醛（AR級）溶液中加入900 mL的0.85%的NaCl溶液，然后加入0.80 g的混合藥品（6.10 g的Na2HPO4和0.15 g的NaH2PO4充分混合）〔13-14〕。

糞便樣品：現場采集的黑白仰鼻猴新鮮糞便樣品18份，糞便樣品供體為保護區南片的塔城鎮響姑箐黑白仰鼻猴猴群，該群由8個OMU（one male unit繁殖單元，即一雄多雌單元）和1個AMU（all male unit，即全雄單元）組成，共90個個體，所有成年個體均能個體識別。糞便樣品采集時將同一個體的所有糞便顆粒進行采集，記錄糞便樣品供體信息后放入自封袋中。

1.3 樣品保存將采集的樣品在1 h內帶回野外基地實驗室，每份樣品稱量后分成2份（每份30 g），分別放入樣品管內進行分兩組保存，其中A組加入福爾馬林保存液保存并將其放置實驗室陰涼通風處，B組直接放入-20 ℃冰箱保存〔8〕，A、B兩組各18個樣品。

1.4 糞便寄生蟲蟲卵鏡檢及計數在取樣當天至第7天每天分別對A、B組取樣進行實驗，之后第10天，第15、20、30天對A、B組分別取樣實驗，如檢出強度下降至30%以下則停止檢測。

實驗方法為飽和硫酸鋅漂浮法。A、B組分別稱取1 g（±5%）糞樣置于50 mL燒杯中，加至20 mL的無菌水攪拌混勻后，經50目網篩過濾，將濾液置20 mL的離心管中，1 500 r∕min，離心5 min，去上清液，加飽和硫酸鋅溶液至 5.0 mL，搖勻，待用〔8，11，15-16〕。用滴管吸取適量樣品至麥克馬斯特蟲卵計數板計數室內，40倍物鏡下鏡檢計數，每樣重復計數4次后取平均值計算出檢出強度〔17-18〕，最后得出每克糞便的蟲卵數量。

檢出率=（檢驗結果為陽性樣本數∕總樣本數）×100%

檢出強度（每克蟲卵數量）=計數室的蟲卵總數×（計數室容積0.10 mL ∕5.0 mL）

1.5 數據分析采用配對t檢驗分析-20℃冷凍和福爾馬林保存液保存黑白仰鼻猴糞便的結節線蟲檢出強度差異；采用χ2檢驗分析兩種保存方法對黑白仰鼻猴糞便結節線蟲檢出率的差異。所有數據用Excel軟件處理，利用SPSS軟件進行統計分析顯著水平設為0.05。

2 結果

兩種方法保存黑白仰鼻猴糞便樣品的結節線蟲蟲卵檢出率有差異，-20℃冷凍保存下結節線蟲蟲卵的檢出率高于福爾馬林保存液保存法（χ2=45.10，P＜0.01）。-20℃冷凍保存結節線蟲蟲卵的檢出率是88.89%（56∕63）；福爾馬林保存液保存下結節線蟲的檢出率是30.16%（19∕63）。

兩種方法保存的黑白仰鼻猴糞便樣品結節線蟲蟲卵的檢出強度存在差異，-20℃冷凍保存下糞便結節線蟲的檢出強度高于福爾馬林保存液保存（t=6.799，P＜0.001，df=62）。-20℃冷凍保存下結節線蟲的檢出強度為（919.69± 916.09）個∕g，福爾馬林保存液保存下結節線蟲的檢出強度為（106.62±212.46）個∕g。見圖2。

同時兩種方法保存糞樣的結節線蟲蟲卵檢出強度隨保存時間增加出現差異，在第4天，福爾馬林保存液保存的糞便樣品結節線蟲的檢出強度出現下降，而冷凍保存下的糞便樣品結節線蟲的檢出強度在1～10 d一直維持在較為穩定的檢出強度。兩種保存方法下，前3 d的結節線蟲檢出強度無差異，第4～10天開始出現差異，差異在第5天達最大。見表1。

圖2 不同保存方法及保存時間下黑白仰鼻猴糞便樣品中結節線蟲檢出強度

表1 蟲卵檢出強度隨保存時間（1～10 d）的變化

在兩種方法保存效率出現顯著差異之后，繼續對-20℃冷凍保存條件下的樣品進行了保存時間的驗證，結果顯示，結節線蟲的檢出率1～30 d的保存時間內沒有下降（88.89%），平均檢出強度維持在65%（973.89～633.03 個∕g）。見圖3。

圖3 -20℃冷凍保存1～30 d黑白仰鼻猴糞便樣品的結節線蟲蟲卵的檢出率和檢出強度

3 討論

本文首次以結節線蟲為例對黑白仰鼻猴糞便樣品在-20℃冷凍保存與福爾馬林保存液保存的保存效果進行了對比研究，通過對兩種保存條件下不同保存時間內糞便樣品中的結節線蟲的檢出強度及檢出率的比較，發現在-20℃冷凍保存條件下的糞便樣品保存效果明顯好于福爾馬林保存液。-20℃冷凍保存的檢出強度一直到第10天都維持在60%，30 d內維持在50%；在福爾馬林保存液條件下的糞便樣品在保存第3天之后結節線蟲的檢出強度就下降至4.98%；檢出率上冷凍保存的樣品30 d內并沒有下降，而福爾馬林保存液保存樣品檢出率最低下降至30.16%，因此針對結節線蟲的糞便樣品冷凍保存效果更好，可以維持較高的檢出率及檢出強度，同時保存時間更加長久〔19〕。針對研究野生動物等不易及時獲得糞便樣品的對象時，糞便樣品的保存是一個極為重要的步驟，當糞便樣品保存不當將會對實驗結果產生較大的影響〔17〕。相對其他的液體保存劑而言，用福爾馬林保存液保存糞便樣品，固定后的樣品可以用于一些免疫學檢驗，短時間內對于鏡檢檢出率還是有一定的保證。但是相對于冷凍保存而言，福爾馬林溶液保存的糞便樣品在檢出強度上存在不穩定性，因而對于定量的研究而言應盡量選用低溫保存，且福爾馬林溶液保存糞便樣品在保存過程中會因為溶液與蟲卵內的滲透壓差產生變形對后期的鏡檢結果產生很大的影響，同時福爾馬林溶液對保存滋養體而言效果也很不理想。

冷凍保存的時間一般也不建議過久，過久之后部分蟲卵也會因為失水導致破裂，本研究低溫冷凍保存在30 d內對結節線蟲蟲卵的檢出強度及檢出率影響都較小，故在針對野生動物的糞便寄生蟲檢驗研究中可以利用低溫保存法保存糞便樣品。近期車載冰箱已經較為普遍，可以事先冷凍好冰袋置于便攜式車載冰箱內，將獲取的野生動物糞便用取樣管分裝好，置于有冰袋的便攜式車載冰箱內，并帶回車上，盡快送回實驗室進行檢驗，就可實現樣品的短期低溫保存，并能有效的抑制寄生蟲蟲卵的發育，經過長期的野外試驗作者已經證實該方法的可行性。

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