雞足山水生絲孢菌資源調查

趙 娜，保丹鳳 ，李文麗，羅宗龍，蘇鴻雁*

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.大理市血吸蟲病防治站，云南大理 671000；3.大理大學農學與生物科學學院，云南大理 671003）

水生真菌是指整個生活史或部分生活史依賴于淡水環境的真菌，它們是一個生態復合群，具有豐富的多樣性〔1〕。1942年Ingold第一個發現并報道水生真菌〔2〕，隨后引起了科學家的廣泛關注，許多新屬、新種相繼被報道。為了紀念Ingold對水生真菌做出的貢獻特將此類真菌命名為Ingoldian真菌。子囊菌（Ascomycetes）及其無性型是水生真菌中種類最多的類群，子囊菌的無性型包括絲孢菌（Hyphomycetes）和腔孢菌（Coelomycetes）〔3〕。

水生真菌在自然水體或部分人工水體中都能生存。Wong等〔4〕將水生真菌生存的淡水環境分為3類：①靜態水體，如：湖泊、池塘、濕地、樹洞等；②動態水體，如：河流，溪流等；③人工水體，如：水塔，水渠等。Raja等〔5〕通過比較美國弗羅里達州大量動態水和靜態水中的水生真菌群落，認為水生真菌在動態水體和靜態水體中真菌群落結構并無顯著差異。水生真菌是一個可供人類開發利用的資源寶庫，它能分解木質素、半木質素及纖維素，并且能產生多種生物活性物質，如：抗生素、殺蟲劑、多糖等〔3〕。

研究顯示，地理氣候條件〔6〕、植被〔7〕、生長基質〔8〕、水質〔9〕等多種因素都會影響水生真菌的群落結構和多樣性。云南物種資源豐富，滇西北更是全球生物多樣性的熱點地區之一。20世紀80年代楊發蓉等對滇池〔10〕、洱海〔11〕、長湖〔12〕等地的水生真菌進行研究，從此拉開了云南地區水生真菌研究的序幕。2000年，云南大學研究人員對云南不同地域水生真菌群落多樣性及其生態方面進行了系統性研究〔13-14〕。Hu等〔15〕統計，中國內陸已記錄的水生絲孢菌有416種，占已報道總數的48.8%。Su等〔16〕、Luo等〔17〕等開始對瀾滄江〔18〕、獨龍江〔19〕、怒江、金沙江、蒼山〔20-21〕、洱海〔22〕等地的水生真菌進行系統性研究。

雞足山地處滇西高原，橫斷山脈東側，位于東經100°20′～100°25′，北緯25°56′～26°00′之間，山體相對高差1 500 m左右，干濕季分明，全年降水極不均勻，5～10月為雨季，降水量占全年降水量的89%〔23〕。得天獨厚的地理環境及氣候使得雞足山植被多樣、物種資源豐富，但至目前為止，尚未發現有關雞足山水生真菌資源的研究報道。本次研究對雞足山水生絲孢菌資源進行調查，目的是了解雞足山水生絲孢菌資源狀況及多樣性特征，為以后雞足山水生真菌的開發利用奠定基礎。

1 方法

1.1 樣品采集2016年10月，在雞足山海拔2 196～2 449 m的山間溪流中采集沉水腐木。腐木一般選擇浸泡時間長，腐爛充分（用指甲能掐出凹陷），直徑1～5 cm，長20～30 cm的腐木，共采集120份，將采集好的腐木裝入自封塑料袋中，帶回實驗室進行保濕培養，并記錄采集樣品地點的海拔、水溫及pH值。

1.2 培養基配制WA培養基（水-瓊脂培養基）：瓊脂條18 g，蒸餾水1 000 mL〔20〕；PDA培養基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基）：瓊脂條18 g，去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL〔20〕；MEA培養基（麥芽浸粉瓊脂培養基）：瓊脂條18 g，大豆蛋白胨3 g，麥芽浸膏 30 g，蒸餾水1 000 mL〔24〕。以上培養基需經高壓蒸汽滅菌（121℃，20 min），冷卻至45℃時加入終濃度為0.5 mg∕mL的阿莫西林混勻，倒入平板冷卻備用。

1.3 樣品培養將吸水紙、塑料吸管用高壓蒸汽滅菌（121℃，20 min），烘干備用。用75%的酒精擦拭保鮮盒，晾干備用。將吸水紙放入保鮮盒中，再在吸水紙上放置3～4根塑料吸管以作為支撐以避免樣品與底部接觸，倒入無菌水使吸水紙充分濕潤，然后將采集回來的腐木放入保鮮盒中，每盒放10根腐木，寫上編號，將保鮮盒置于室溫下無陽光直射的地方培養，培養期間需不定期打開保鮮盒適當通氣，且需適當添加無菌水以保持樣品濕潤。

1.4 形態觀察樣品保濕培養1周后，在GL-99BI連續變倍體視鏡下觀察樣品，找到目的菌株后先用Nikon-SMZ 1000體視顯微鏡拍攝其外部形態，再用無菌針頭將鎖定的菌株挑下，以無菌水作為浮載劑制成水封片，在OLYMPUS BX51生物顯微鏡下觀察并進行微觀拍照。

1.5 樣品拍照及拼圖每個菌種要求拍攝10～20個完整的分生孢子梗及產孢結構，至少30個分生孢子的形態以及其他完整的特征。將真菌的外部形態、分生孢子、分生孢子梗、產孢結構及其他特征，萌發的分生孢子及純培養的照片，用軟件Photoshop CS5拼成完整的圖版。

1.6 樣品分離與純化在GL-99BI連續變倍體視鏡下用無菌牙簽將鎖定的分生孢子挑下，轉移至事先備好的PDA或WA培養基內，要求每個培養基內至少有5～7個獨立的分生孢子。將培養基放置于室溫下培養。24 h后在體視鏡下觀察，挑取1～2個已萌發的孢子制成封片后置于OLYMPUS BX51生物顯微鏡下拍攝其萌發照片，將已萌發的孢子轉移至備好的PDA培養基內，用封口膜將平板封住后置于室溫下培養，定期檢查菌落的生長狀況。以上整個過程均要求無菌操作，避免污染。

1.7 菌種及干標本保存用MEA斜面試管保存菌種。切下長有真菌子實體的木片風干后，放入信封并放入1粒樟腦丸，采用此種方法可長期保存。

1.8 菌株鑒定根據相關文獻〔24-32〕，通過比較分生孢子梗及產孢結構的形態特征，分生孢子的著生方式、大小、形狀、顏色、有無分隔以及附屬物的不同，對其進行形態學鑒定。

1.9 數據分析

檢出率（%）=（某個種出現的次數∕樣品總數）×100%

采用香農-維納指數（H′）分析雞足山水生絲孢菌的多樣性〔3〕。香農-維納指數為：

其中，Ni為第i個菌種的檢出次數，N為所有菌種的檢出次數，Pi是某種菌種數量占所有菌種數量的百分比，S是所有菌種的種數。

2 實驗結果

對120份沉水腐木進行鏡檢，分離、純化，通過形態學進行鑒定，鑒定出水生絲孢菌20屬，40種。其中檢出率最高的屬為：Helicosporium（23.08%），其次是Dactylaria（18.46%）、Ellisembia（10.77%），最低的是Arachnophora（1.54%）、Beltrania（1.54%）等12個屬。見表1。雞足山水生絲孢菌的多樣性指數為2.49。各樣品采集地點的海拔、溫度、pH值和水生絲孢菌多樣性指數見表2。

表1 雞足山水生絲孢菌屬級檢出率

表2 雞足山各樣本采集地點的地理信息及水生絲孢菌的多樣性

3 討論

本研究共鑒定出水生絲孢菌20屬40種，其中檢出率最高的是Helicosporium（23.08%），其次是Dactylaria（18.46%）、Ellisembia（10.77%），最低的是Arachnophora（1.54%）、Beltrania（1.54%）等12個屬，共獲得雞足山水生絲孢菌純培養23株，香農-維納指數為2.49，2015年劉曉英等〔20〕報道的蒼山萬花溪和黑龍溪水生絲孢菌多樣性分別為2.22和3.67，與之相比，雞足山水生絲孢菌多樣性高于蒼山萬花溪水生絲孢菌多樣性，但低于蒼山黑龍溪水生絲孢菌多樣性，說明雞足山水生絲孢菌物種豐富。分析原因有以下幾點：第一，此次研究地點為大理州賓川縣雞足山，其地理位置特殊，立體氣候顯著，植被多樣〔33〕，為水生真菌提供了不同的生存溫度及生長基質，這些因素都會影響水生真菌的多樣性〔34〕；第二，可能與樣本采集時間、采集方法及樣本量有關，本研究樣本采集時間在10月份為雨季，蒼山萬花溪和黑龍溪的樣本采集時間在3月份為旱季〔20〕，楊發蓉等〔10-11〕研究指出旱季水生真菌的類群和數量明顯多于雨季；第三，可能與其他環境因素有關，已有研究證明環境因素會影響微生物的分布〔35-37〕，如地理距離〔38〕、海拔〔39〕、溫度〔40〕、植被〔34〕、化學因子〔41〕及環境污染〔42〕。Geml等〔39〕對阿根廷安第斯山脈的土壤真菌進行研究后得出：真菌群落的物種組成與海拔高度密切相關。Wu等〔43〕研究發現在1 000～4 000 m海拔范圍內，淡水真菌多樣性的變化主要受地理位置和海拔的影響。在此次調查中，各樣品采集地點的海拔依次為2 196、2 351、2 387和2 449 m，溫度分別為13.7、13.1、13.0和13.1℃，各地點對應的pH值分別為7.57、7.45、7.32和7.50，香農-維納指數依次為1.64、2.16、2.43和1.56，可看出多樣性與海拔關系不密切，這可能是由各采樣地點間海拔梯度、溫度及pH三者的變化不大且樣本量不統一所致，根據以上數據無法分析雞足山水生真菌多樣性變化與海拔、溫度及pH之間的關系。Sheare等〔44〕預測淡水中有大量水生真菌有待研究發現，并指出中國是調查報道最少的地區之一，此次研究結果彌補雞足山水生真菌研究的空白，為以后水生真菌資源的研究、開發利用奠定了菌種資源基礎。

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