明膠-殼聚糖-海藻酸鈉凝膠包埋木瓜蛋白酶的研究

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(1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心,北京工商大學,北京 100048;2.食品添加劑與配料北京市高校工程研究中心,北京 100048)

海藻酸鈉是由1,4-聚-B-D-甘露糖醛酸和A-L-古羅糖醛酸構成的線型聚合物,其具有無毒無害、不容易降解及生物相容性好等優點[1-2]。在溫和條件下,海藻酸鈉可以實現對蛋白質等生物大分子的包埋[3]。殼聚糖分子構成為(1,4)-2-氨基-2脫氧-β-D-葡萄糖胺,是天然多糖高分子材料[4],因其無毒、具有生物可降解性、生物活性等特性而具有廣泛應用[5-6]。明膠是由膠原部分水解而得到的一類蛋白質,具有組織相容性、低抗原性、成膜性等優良特性[7-8],為固定化酶的優良載體[9]。用于固定化酶的天然高分子材料還有淀粉、甲殼素等[10]。因明膠、殼聚糖、海藻酸鈉來源廣泛、生物相容性好、成本低廉等優點,故選作本研究固定化酶的載體。

近年來,使用復配材料逐漸成為固定化酶研究的熱門。張智等[11]利用海藻酸鈉、海藻酸鈉-明膠、海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶,根據酶學特性得到最佳載體為海藻酸鈉-殼聚糖混合材料。陸兵等[12]對紅芝LYL263漆酶進行不同凝膠體系的固定化研究發現海藻酸鈉-殼聚糖-明膠固定化漆酶酶活最高。微膠囊作為固定化載體,擴散性是一重要指標[13]。有研究者指出有明膠參與的膠囊網孔更大,更有利于物質的包埋和內外物質的擴散[14]。但純明膠存在干燥后質地脆、可被蛋白酶酶解[15]等缺點,通常對明膠進行改性處理以提高其穩定性等性能。

本文分別使用明膠和改性明膠與殼聚糖、海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶,以硬度和酶活為指標進行比較研究,評價了使用明膠和改性明膠對固定化木瓜蛋白酶的影響,為固定化木瓜蛋白酶提供了一種新思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

海藻酸鈉、殼聚糖、明膠、無水CaCl2、鹽酸、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、無水碳酸鈉、三氯乙酸、25%溶液戊二醛 國藥集團化學試劑有限公司;木瓜蛋白酶(活力4.96×105U/g)、福林酚試劑、三羥甲基氨基甲烷 Sigma公司;干酪素 北京奧博星生物技術有限責任公司;L-酪氨酸 天津市光復精細化工研究所;L-谷胱甘肽 拜爾迪生物技術有限公司。

CP214電子天平 上海市奧豪斯儀器有限公司;pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;CT-3質構儀 美國Brookfield公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司;DF-101S恒溫磁力攪拌鍋 河南省鞏義市予華儀器有限責任公司;超聲波清洗機 南京先歐生物科技有限公司;UVmini-1240紫外可見光分光光度計 日本島津公司。

1.2實驗方法

1.2.1 明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉對木瓜蛋白酶的包埋

1.2.1.1 明膠-殼聚糖-海藻酸鈉對木瓜蛋白酶的包埋 稱取一定質量的明膠、殼聚糖、海藻酸鈉,溶于100 mL一定pH0.1 mol/L的Tris-鹽酸緩沖液中,磁力攪拌30 min至完全溶解，冷卻至室溫后取20 mL。然后加入0.01 g木瓜蛋白酶,攪拌均勻。用一次性滴管將上述攪拌均勻的溶液緩慢滴入一定濃度的CaCl2中,形成凝膠球。放入4 ℃冰箱儲存,30 min后將凝膠球撈出,用去離子水反復洗凈,濾干,用于測定酶活。

為便于測定凝膠球硬度,將其制備成相應的凝膠塊,在燒杯中加入5 mL一定濃度CaCl2溶液鋪滿燒杯底部,取80 mL凝膠液迅速倒入其中,然后沿燒杯壁緩慢加入CaCl2溶液,可制得凝膠塊(厚(1.3±0.1) cm),放入4 ℃冰箱,24 h后測硬度。

1.2.1.2 改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉對木瓜蛋白酶的包埋 采用前人研究的結果[16],使用明膠抗水解能力強的條件改性明膠:稱取4 g明膠溶于20 mL、pH6的PBS緩沖液,溶解后加入0.9%戊二醛改性16 min。得到改性明膠溶液,改性明膠濃度為0.2 g/mL。

稱取殼聚糖與海藻酸鈉粉末,溶于一定體積一定pH的Tris-鹽酸緩沖液,加入相應體積的改性明膠,磁力攪拌30 min至完全溶解，冷卻至室溫后取20 mL加入0.01 g木瓜蛋白酶,攪拌均勻。用一次性滴管將上述攪拌均勻的溶液緩慢滴入一定濃度的CaCl2中,形成凝膠球,放入4 ℃冰箱儲存,30 min后將凝膠球撈出,用去離子水反復洗凈,濾干,用于測定酶活。

為便于測定凝膠球硬度,將其制備成相應的凝膠塊,在燒杯中加入5 mL一定濃度CaCl2溶液鋪滿燒杯底部,取80 mL凝膠液迅速倒入其中,然后沿燒杯壁緩慢加入CaCl2溶液,制得凝膠塊(厚(1.3±0.1) cm),放入4 ℃冰箱,24 h后測硬度。

1.2.2 明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶單因素實驗

1.2.2.1 不同質量濃度組成對包埋木瓜蛋白酶的影響 根據預實驗成球效果確定明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉的質量濃度見表1,其中固定CaCl2濃度為0.6 mol/L,Tris-鹽酸緩沖液pH7。

表1 明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉的質量濃度Table 1 Gelatin/modified gelatin-chitosan-sodium alginate concentration

1.2.2.2 CaCl2濃度對包埋木瓜蛋白酶的影響 用0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mol/L的不同濃度的CaCl2溶液,其中固定明膠、改性明膠質量濃度均為0.3%、殼聚糖質量濃度為0.3%、海藻酸鈉質量濃度為2.4%,Tris-鹽酸緩沖液pH7。

1.2.2.3 緩沖液pH對包埋木瓜蛋白酶的影響 使用pH6、6.5、7、7.5、8的Tris-鹽酸緩沖液,其中固定明膠、改性明膠質量濃度均為0.3%、殼聚糖質量濃度為0.3%、海藻酸鈉質量濃度為2.4%,CaCl2濃度0.6 mol/L。

表2 使用明膠/改性明膠的優化實驗因素水平表Table 2 Factors and levels table for the trial of gelatin/modified gelatin

1.2.3 明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶優化實驗 根據單因素實驗的結果選擇較優變化的范圍,確定相應的水平,最終確定均勻優化實驗方案,選取明膠/改性明膠質量濃度、殼聚糖質量濃度、海藻酸鈉質量濃度、CaCl2濃度、以及緩沖液pH五個因素。綜合考慮硬度酶活兩個指標,利用DPS軟件設計均勻實驗優化方案見表2。

1.2.4 酶活力測定方法 參照福林酚法測酶活[17-18]酶活力單位定義為在1 min內催化酪蛋白水解生成1 μg酪氨酸的酶量為一個活力單位(U)。固定化酶活力單位根據載體質量以U/g表示。

1.2.5 硬度測定方法 參照bloom法[19],使用CT-3質構儀,測定條件為:柱塞P0.5;壓力5 g,速度1 mm/s。每個樣品作三個平行樣,重復測定三次取平均值。

1.3數據處理

實驗中每個處理重復三次,實驗各值均為三個平行數據的均值。采用DPSv15.10數據處理系統進行均勻實驗設計。數據統計結果與分析應用 Microsoft Excel 2007、Origin 9.0和SPSS 22.0軟件。

2 結果與分析

2.1明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉共混固定木瓜蛋白酶單因素實驗

2.1.1 不同質量濃度組成對包埋木瓜蛋白酶的影響 結果分別見圖1、圖2。

圖1 三種組成成分對硬度的影響Fig.1 Effect of the three components on the hardness

根據圖1得出使用改性明膠與使用明膠相比對硬度的影響無顯著性差異,這與體系中明膠的量較少,硬度主要受海藻酸鈉的影響有關。由圖2可知,一定組成的明膠、殼聚糖和海藻酸鈉包埋可以提高酶活,使用明膠制備得到第5組酶活最大。使用改性明膠第6組酶活最大。根據此結果同時考慮到三種物質組成的體系復雜,三者相互作用未知,優化實驗選擇相應物質的濃度范圍進行優化,確定明膠濃度范圍0.15%～0.45%,殼聚糖濃度范圍0.15%～0.45%,海藻酸鈉濃度范圍2.25%～2.55%;改性明膠濃度范圍0.15%～0.45%,殼聚糖濃度范圍0.15%～0.45%,海藻酸鈉濃度范圍2.25%～2.55%。第4、5組使用明膠的酶活顯著高于使用改性明膠的酶活(p<0.05),6、8、9、10組使用改性明膠酶活顯著提高(p<0.05)。酶活變化情況復雜分析原因與體系的復雜組成有關,海藻酸鈉是固定化酶顆粒成球的主要因素,濃度較低時,表面形成的固定化膜強度不夠,容易分離,造成酶活力低。當海藻酸鈉濃度過高時,顆粒表面結構致密膜強度高,造成酶活降低。殼聚糖濃度過高也會使固定化顆粒表面膜致密,造成底物擴散困難,降低酶活[20]。明膠濃度影響凝膠結構的孔徑[21],適宜濃度的明膠可以提高酶活。實驗結果表明一定組成條件下明膠改性后可提高酶活。推測明膠改性后發生變化,與殼聚糖-海藻酸鈉之間產生影響,對其固定化酶結構或酶產生了影響。

2.1.2 CaCl2濃度對包埋木瓜蛋白酶的影響 結果分別見圖3、圖4。

圖3 CaCl2濃度對硬度的影響Fig.3 Effect of CaCl2 concentration on hardness

圖4 CaCl2濃度對酶活的影響Fig.4 Effect of CaCl2 Concentration on enzyme activity

由圖3可以得出,凝膠硬度隨CaCl2濃度上升而提高,使用改性明膠和使用明膠相比硬度無顯著性差異。由圖4得到酶活隨CaCl2濃度增大先增大后減小。Yen[22]利用海藻酸鈉膠囊固定化米根霉研究發現CaCl2增會增加固定化膠囊的厚度,增加傳質阻力。CaCl2濃度增大可能增加酶擴散阻力,導致CaCl2濃度增加酶活降低。有研究者研究得到CaCl2濃度高不利于酶活[19]。

表3 使用明膠均勻實驗結果表Table 3 Uniform experimental results of gelatin

解釋為當CaCl2較高時,鈣離子會布滿凝膠表面,影響酶的作用,從而不利于酶活。使用改性明膠后酶活提高,改性后明膠抗酶解能力顯著增強[15],明膠更好發揮其作用,更有利于物質的包埋和內外物質的擴散[13]。改性明膠酶活最大值18.99 U/g,使用明膠最大酶活12.51 U/g,使用改性明膠與明膠相比提高了52%。

2.1.3 pH對對包埋木瓜蛋白酶的影響 結果分別見圖5、圖6。

圖5 pH對硬度的影響Fig.5 Effect of pH on hardness

圖6 pH對酶活的影響Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

由圖5可知,硬度在pH7.5時出現最大值。黃正華等[23]研究海藻酸鈉殼聚糖凝膠,pH7時凝膠硬度達到最大。趙謀明等[24]研究表明,離子強度明顯影響海藻酸鈉和明膠的相互作用,推出明膠與海藻酸鈉主要為靜電力作用。pH過低時,海藻酸鈉含量多,帶負電荷少起作用,使三者靜電作用力小硬度低。pH過高,海藻酸鈉相互間存在斥力,明膠-殼聚糖與海藻酸鈉靜電吸引作用小,硬度下降。使用改性明膠與使用明膠的結果對比,在pH6.5、7.5時,明膠改性后硬度降低了25%、20%,孫言蓓等[25]利用乙二胺改性,使得明膠部分基團發生變化,氨基增加,使得明膠溶液黏度降低。在pH6.5、7.5明膠改性后可能對體系粘度產生影響從而使得硬度發生改變。圖6結果表明,酶活隨pH先增大后減小,pH7時酶活最大。游離木瓜蛋白酶最適合pH7,固定化后最適合pH未改變。使用改性明膠酶活最大值21.66 U/g,使用明膠酶活最大值14.67 U/g,使用改性明膠使酶活提高了48%。

2.2明膠/改性明膠-殼聚糖-海藻酸鈉固定木瓜蛋白酶優化實驗

根據DPS軟件設計均勻實驗并進行實驗。使用明膠和改性明膠結果分別如表3、表4所示,采用偏最小二乘回歸分析方法對混合水平均勻實驗結果進行分析。得到最優條件:明膠質量濃度0.45%,殼聚糖質量濃度0.42%,海藻酸鈉質量濃度2.55%,CaCl2濃度0.8 mol/L,緩沖液pH7.5;改性明膠質量濃度0.45%,殼聚糖質量濃度0.15%,海藻酸鈉質量濃度2.55%,CaCl2濃度0.8 mol/L,緩沖液pH6.5。

表4 使用改性明膠均勻實驗結果表Table 4 Uniform experimental results of modified gelatin

表5 理論值與實測結果比較Table 5 Comparison of theoretical values with measured results

在最優條件下進行兩組驗證實驗,將得到的實際值與數據處理系統得到的預測值進行比較,如表5所示。使用明膠酶活相對誤差3.68%,硬度相對誤差9.25%;使用改性明膠酶活相對誤差8.30%,硬度相對誤差7.30%。數據系統分析模型的理論值與實測值相比可以說明預測模型具有一定的指導意義。對比使用改性明膠與使用明膠的優化實驗結果發現,使用改性明膠后殼聚糖濃度、緩沖液pH更低,其他得到的優化條件相同。對比采用優化條件進行實驗得到的酶活和硬度的結果,與使用明膠相比,使用改性明膠的酶活提高37%,硬度減少35%。

3 結論

本實驗在單因素實驗基礎上,通過均勻實驗,確定兩組最佳條件:明膠質量濃度0.45%,殼聚糖質量濃度0.42%,海藻酸鈉質量濃度2.55%,CaCl2濃度0.8 mol/L,緩沖液pH7.5。改性明膠質量濃度0.45%,殼聚糖質量濃度0.15%,海藻酸鈉質量濃度2.55%,CaCl2濃度0.8 mol/L,緩沖液pH6.5。驗證實驗證明數據分析系統建立的模型具有一定指導意義。使用改性明膠可提高酶活,但硬度降低,與明膠相比酶活提高37%,硬度減少35%。

固定化木瓜蛋白酶的硬度和酶活受明膠、殼聚糖、海藻酸鈉、CaCl2濃度和緩沖液pH等多種因素的影響。在今后的研究中,可以根據不同的研究目的選擇使用明膠還是改性明膠,如考慮提高酶活,可以使用改性明膠。雖然目前對明膠、殼聚糖、海藻酸鈉相互作用形成凝膠有一定的認識,但還不夠深入,在機理等方面還有待于進一步的研究和探索。

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