谷氨酰胺轉氨酶對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

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(北京林業大學生物科學與技術學院,林業食品加工與安全北京市重點實驗室,北京 100083)

山杏(Armeniacasibirica(L.)Lam)屬于薔薇科(Rosaceae)杏屬(Armeniaca)植物,又稱西伯利亞杏,是我國重要的野生植物資源[1]。山杏仁油脂含量高(約50%)[2],而榨油后剩余的餅粕中蛋白質含量高達45.3%[3],且以易消化的低分子清蛋白為主,占總量的80%以上,而較難消化的大分子球蛋白不到10%[4]。研究發現山杏仁蛋白含有17種氨基酸,其中8種為人體所必需的氨基酸,約占總量的28%,且纈氨酸(6.65)和異亮氨酸(7.79)含量顯著高于聯合國糧農組織(FAO)的推薦值(5.0和6.0)[5],因此,山杏仁蛋白是一種食用價值極高的植物蛋白。

凝膠性是植物蛋白重要的功能特性之一,采用谷氨酰胺轉氨酶(TG酶)作為交聯劑促進蛋白質凝膠的形成已成為蛋白質酶法改性的重要手段。它以肽鏈中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基作為酰基供體,通過催化其與酰基受體間的酰基轉移反應促使交聯現象的發生[6]。目前,針對山杏仁蛋白的研究主要集中在提取工藝及乳化性、起泡性、溶解性,而對凝膠特性研究還未有報道。顧欣[7]等用響應面法優化了山杏仁蛋白的提取工藝,蛋白的提取率達到92.35%;薛蕾[8]等研究了pH、NaCl濃度、溫度對苦杏仁蛋白溶解性、乳化性及起泡性的影響,發現在等電點附近各項性質均最差,NaCl濃度在0～0.8 mol/L以及適宜的溫度(35～55 ℃)均有利于提高各項性質。本文在前期研究的基礎上,利用堿溶酸沉法提取山杏仁蛋白,采用TG酶作為交聯劑,分析工藝參數對其凝膠特性的影響,通過響應面優化得到最佳交聯條件,為山杏仁餅粕的深加工與利用提供理論依據及技術指導。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

脫脂山杏仁粉 河北承德亞歐果仁有限公司,用石油醚脫脂,過80目篩;谷氨酰胺轉氨酶(200 U/g,TG) 江蘇省泰興市一鳴生物制品有限公司;其余所用試劑 均為國產分析純。

1.2實驗方法

1.2.1 山杏仁蛋白的提取 脫脂山杏仁粉按1∶10加入去離子水,超聲破碎10 min,1 mol/L NaOH調節溶液pH至9,45 ℃磁力攪拌提取1 h,4000 r/min離心15 min,上清液用1 mol/L HCl調節溶液pH至4.1,4000 r/min離心15 min,沉淀用去離子水復溶,pH調節至中性,冷凍干燥得到山杏仁分離蛋白(蛋白質含量可達84.52%),-18 ℃下保存備用。

1.2.2 山杏仁蛋白凝膠的制備 配制16%(w/v)的山杏仁蛋白溶液,調節溶液pH至7,按一定的量加入TG酶,分別在一定的溫度下反應一定的時間,然后90 ℃滅酶15 min,將樣品置于冰水浴中迅速冷卻至室溫,置于4 ℃冰箱中保存12 h,然后測定其凝膠硬度、彈性和內聚力。

1.2.3 凝膠特性的測定 參照何軒輝[9]的方法,略微修改。采用Perten TVT 6700質構儀,選擇直徑為20 mm的TVT 673020型圓柱探頭、TVT 675088型平板基臺。設置參數:測前速度為2.0 mm/s;測試速度為0.8 mm/s;測后速度為0.8 mm/s;壓縮比50%;數據采集速率為200 pps。一次測定過程中探頭下壓兩次,凝膠硬度為第一次壓縮過程中的峰值,彈性為第二次開始壓縮到壓縮結束的總時間與第一次開始壓縮到壓縮結束的總時間的比值,內聚力為第二次壓縮峰下面積與第一次壓縮峰下面積的比值。每個樣品重復測定5次。

1.2.4 單因素實驗設計

1.2.4.1 加酶量對蛋白凝膠特性的影響 固定pH為7,交聯溫度40 ℃,交聯時間1 h,考察不同的加酶量(0、4、8、12、16、20、24、28 U/g)對蛋白凝膠硬度、彈性和內聚力的影響。

蘭州石化始終堅持“環保優先、安全第一、質量至上、以人為本”的理念，強化HSE體系建設，常年堅持開展公司、分廠和車間三級崗位責任制大檢查，建立了四級風險“管控網”，形成了專業監督、專職檢查、干部走動式巡檢、值班檢查“四位一體”的監督檢查體系，做到了現場作業風險識別管控全過程、全覆蓋。蘭州石化嚴格執行環保新標準，推進清潔生產、綠色發展。5年來，公司重點環保項目建設投入達到20多億元，減排成效顯著。

1.2.4.2 pH對蛋白凝膠特性的影響 固定加酶量16 U/g,交聯溫度40 ℃,交聯時間1 h,考察pH(5、6、7、8、9)對蛋白凝膠硬度、彈性和內聚力的影響。

1.2.4.3 溫度對蛋白凝膠特性的影響 固定加酶量16 U/g,pH為7,交聯時間1 h,考察交聯溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對蛋白凝膠硬度、彈性和內聚力的影響。

1.2.4.4 時間對蛋白凝膠特性的影響 固定加酶量16 U/g,pH為7,交聯溫度40 ℃,考察交聯時間(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 h)對蛋白凝膠硬度、彈性和內聚力的影響。

1.2.5 響應面實驗 在單因素實驗的基礎上,以凝膠硬度為考察指標,選取TG酶添加量、交聯溫度、pH、交聯時間為實驗因素,確定凝膠形成的最佳條件,響應面實驗因素水平表見表1。

表1 響應面實驗因素與水平Table 1 Factors and levels table of response surface experiment

1.2.6 數據處理 采用Microsoft Excel(Office 2013)、Design Expert 7.0、SPSS Statistics 21軟件進行分析。顯著性分析采用Duncana新復極差法比較,p<0.05認為結果差異顯著。

2 結果與分析

2.1TG酶添加量對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

圖1 加酶量對山杏仁蛋白凝膠特性的影響Fig.1 Effect of TG amount on the gel properties of apricot protein gel注:同一性質,字母不同者為差異顯著(p<0.05),相同者為差異不顯著(p>0.05);圖2～圖4同。

由圖1可得,隨著TG酶添加量的增加,凝膠硬度呈現出先增加后降低的趨勢,當加酶量為16 U/g時,凝膠硬度達到最大值106 g;彈性在0～8 U/g內增加,之后變化不顯著,在8 U/g時達到最大值0.77;內聚力在16～28 U/g時顯著高于0～12 U/g,在16 U/g時出現最大值0.47。TG酶交聯賴氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上的γ-酰胺基形成共價鍵,促進蛋白質分子間的共價交聯,生成了大分子聚集體,使得蛋白質分子量增大,凝膠硬度也隨之增大[10]。但加酶量過高反而導致蛋白凝膠硬度有所下降,這是因為維系蛋白質凝膠網絡穩定所需的共價鍵的數目已達到飽和,過量的酶可能會導致蛋白質分子表面的作用位點發生交聯,減少了與周圍蛋白質分子交聯的機會[11]。汪亞強[12]等利用TG酶催化制備小麥和大豆蛋白的混合凝膠,發現隨著加酶量的增加,凝膠強度持續增加,但并非一直呈正相關關系。所以選取加酶量在16 U/g。

2.2pH對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

由圖2可知,隨著pH的升高,凝膠硬度和內聚力均呈現先增加后降低的趨勢,在pH為7時達到最大值;彈性在pH為5～7時增加,之后無顯著性變化。反應體系的pH主要影響酶的活性和穩定性,TG酶的最適pH為6.0～7.5,當pH過高或過低,TG酶空間構象發生改變導致活性降低[13];另一方面,當pH接近山杏仁蛋白的等電點(pH4.1)時,蛋白質發生沉淀,無法形成有序的凝膠網狀結構,導致凝膠特性有所降低。袁建[14]等研究了pH對菜籽蛋白凝膠性的影響,發現當pH遠離菜籽蛋白等電點時均具有良好的凝膠性,且堿性條件下的凝膠性高于酸性條件下的凝膠性,所以選取pH為7。

圖2 pH對山杏仁蛋白凝膠特性的影響Fig.2 Effect of pH on the gel properties of apricot protein gel

2.3交聯溫度對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

如圖3所示,隨著交聯溫度的升高,山杏仁蛋白的凝膠硬度呈現先增加后減小的趨勢,在溫度為40 ℃時達到最大值;彈性和內聚力均先增加達到最大值,之后逐漸減小,內聚力在60～70 ℃范圍內卻顯著增加,這可能時因為高溫導致酶失活,此時蛋白質發生熱聚集而非酶促聚集形成凝膠,使得凝膠內聚力有所增加。研究表明TG酶的熱穩定性較好,最適溫度為37～50 ℃,但加熱到70 ℃時活性便完全喪失,從而失去交聯蛋白質的能力[15]。安靜等[16]人研究發現,反應溫度能顯著提高大豆分離蛋白的凝膠強度,40～60 ℃范圍內變化不顯著,在70 ℃時卻顯著降低。所以選取交聯溫度為40 ℃。

圖3 交聯溫度對山杏仁蛋白凝膠特性的影響Fig.3 Effect of temperature on the gel properties of apricot protein gel

2.4交聯時間對山杏仁蛋白凝膠特性的影響

如圖4所示,時間在0.5～2 h范圍內凝膠硬度變化不顯著,在時間達到2.5 h時硬度出現最大值,之后逐漸降低;彈性在0.5～3 h內呈現輕微的先增加后降低的趨勢,其值均較高,在0.71以上,當時間超過3 h卻顯著降低;內聚力在1 h時達到最大值,之后逐漸減小。維系蛋白質凝膠網絡穩定的共價鍵數目有限,當所需共價鍵數目達到飽和,過長時間的交聯反而會導致凝膠網絡結構的破裂,使得蛋白的凝膠特性有所降低[17]。封小龍[18]研究了TG酶交聯時間對花生球蛋白和伴花生球蛋白凝膠硬度的影響,結果表明交聯時間在1～2 h內,花生球蛋白凝膠硬度無顯著變化,伴花生球蛋白凝膠硬度顯著增加,當時間達到2.5 h時兩者的凝膠硬度均顯著降低。所以選取交聯時間2.5 h。

圖4 交聯時間對山杏仁蛋白凝膠特性的影響Fig.4 Effect of treatment time on the gel properties of apricot protein gel

2.5響應面優化實驗

根據單因素實驗結果,依據Box-Behnken中心組合實驗設計原理,運用Design Expert 7.0軟件設計響應面實驗,響應面實驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計方案及結果Table 2 Design and results of response surface methodology experiment

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Variance analysis of mathematical regression model

注:*:p<0.05,顯著;**:p<0.01,極顯著。

采用Design Expert 7.0軟件對響應面實驗數據進行回歸分析,得到山杏仁蛋白凝膠硬度的二次多項回歸模型為:

Y=127.00+4.83A+14.58B+6.83C+2.42D+2.75AB+17.50AC+2.75AD+8.25BC+4.25BD-0.75CD-24.79A2-33.92B2-17.29C2-32.92D2

對上述方程進行方差分析,結果如表3所示。

由表3可知,回歸方程顯著性檢驗F值為14.47(p<0.0001),表明回歸方程在實驗點上的擬合度達到極顯著水平;失擬項檢驗F值為4.60(p=0.0772>0.05),表明差異不顯著,擬合的模型方程效果較好;回歸模型相關系數R2=0.9352,表明模型成立有效。

模型中一次項C、交互項AC、二次項C2影響顯著;B、A2、B2、D2的影響達到極顯著水平。各因素對山杏仁分離蛋白凝膠硬度的影響程度由大到小依次為:交聯溫度(B)>pH(C)>TG酶添加量(A)>交聯時間(D)。

對于雙因素間的交互作用,模型中只有AC(TG酶添加量-pH)交互作用顯著,根據分析結果分別繪制雙因素交互作用的曲面圖和等高線,如圖5所示。由圖5可知,響應面曲線為開口向下的拋物曲面,即在實驗范圍內存在響應值的最大值。當交聯溫度為40 ℃,交聯時間為2.5 h時,TG酶添加量和pH的交互作用對響應值起著二次影響作用。隨著TG酶添加量和pH的增加,山杏仁蛋白的凝膠硬度先增大后減小,在接近中心點時達到最大值。

圖5 TG酶添加量和pH對山杏仁蛋白凝膠硬度的交互作用分析Fig.5 Effect of TG amount and pH on the gel strength of apricot protein gel

對回歸方程進行分析,可得TG酶交聯山杏仁蛋白凝膠的最佳理論工藝參數:TG酶添加量17 U/g,交聯溫度43 ℃,pH為7.2,交聯時間2.5 h,此條件下山杏仁蛋白凝膠硬度的預測值為131 g。為檢驗響應面優化結果的可靠性,在上述條件下進行重復驗證實驗,得到山杏仁蛋白的凝膠硬度為(135±7.14) g,與理論預測值的相對誤差在2.96%左右,說明模型優化所得參數有效,可用于TG酶交聯山杏仁蛋白形成凝膠。

3 結論

利用TG酶交聯山杏仁蛋白形成凝膠,通過單因素實驗考察TG酶添加量、pH、交聯溫度、交聯時間對凝膠硬度、內聚力、彈性的影響,結果表明TG酶對山杏仁蛋白的凝膠硬度、內聚力、彈性均具有明顯的提高作用,其中交聯溫度對凝膠硬度的影響最大,pH、TG酶添加量次之,交聯時間的影響最小。并以凝膠硬度為指標,運用Box-Behnken響應面對條件進行優化,得到凝膠形成的最佳條件為TG酶添加量17 U/g,交聯溫度43 ℃,pH為7.2,交聯時間2.5 h,在此條件下凝膠硬度達到(135±7.14)g。本研究可為實現山杏仁餅粕的深加工與利用提供理論依據及技術指導。

[1]中科院中國植物志編輯委員會. 中國植物志[M]. 北京:科學出版社,1986:27-28.

[2]WANG L B,YU H Y. Biodiesel from Siberian apricot(Prunus sibirica L.)seed kernel oil[J]. Bioresource Technology,2012,112:355-358.

[3]ALPASLAN M,HAYTA M. Apricot kernel:physical and chemical properties[J]. Journal of the American Oil Chemists

Society,2006,83(5):469-471.

[4]EL-AAL M H A,HAMZA M A,RAHMA E H. In vitro digestibility,physico-chemical and functional properties of apricot kernel proteins[J]. Food Chemistry,1986,19(3):197-211.

[5]李科友,史清華,朱海蘭. 苦杏仁氨基酸的營養評析[J]. 林業科技開發,2001,15(4):23-24.

[6]GASPAR A L C,GOES-FAVONI S P de. Action of microbial transglutaminase(MTGase)in the modification of food proteins:A review[J]. Food Chemistry,2015,171:315-322.

[7]顧欣,李莉,侯雅坤,等. 響應面法優化山杏仁蛋白提取工藝研究[J]. 河北林果研究,2010,25(2):162-168.

[8]薛蕾,李大文,尉芹,等. 苦杏仁蛋白的功能特性[J]. 食品科學,2013,34(7):70-75.

[9]何軒輝. 超高壓對花生分離蛋白凝膠特性的影響及其機理研究[D]. 北京:中國農業科學院,2013.

[10]YANG M,LIU F,TANG C H. Properties and microstructure of transglutaminase-set soy protein-stabilized emulsion gels[J]. Food Research International,2013,52:409-418.

[11]徐幸蓮,程巧芬,周光宏. 轉谷氨酰胺酶對蛋白質凝膠性能的影響[J]. 食品科學,2003,24(10):38-43.

[12]汪亞強,羅水忠,鐘昔陽,等. 谷氨酰胺轉氨酶對大豆與小麥混合蛋白凝膠性質的影響[J]. 食品科學,2016,37(21):48-52.

[13]于國萍,安靜,初云斌,等. 轉谷氨酰胺酶催化對大豆分離蛋白凝膠性的影響[J]. 東北農業大學學報,2010,41(10):100-107.

[14]袁建,鞠興榮,何榮,等. 谷氨酰胺轉氨酶改性菜籽蛋白凝膠特性的研究[J]. 食品科學,2010,31(18):10-13.

[15]姜巍巍,于國萍. 轉谷氨酰胺酶對大豆11S蛋白疏水性的影響[J]. 食品工業科技,2009,30(8):96-98.

[16]安靜,于國萍,初云斌,等. 轉谷氨酰胺酶催化對不同大豆蛋白凝膠性的影響[J]. 食品科學,2011,32(6):32-37.

[17]胡曉. 酶法交聯與微射流均質改性花生蛋白及其結構與功能特性的研究[D]. 廣州:華南理工大學,2011.

[18]封小龍. 花生蛋白組分制備、改性及應用研究[D]. 北京:中國農業科學院,2014.