金電極循環伏安法檢測生乳尿素摻雜

,,, ,,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047;2.江西陽光乳業股份有限公司,江西南昌 330043)

生乳是乳制品產業鏈的源頭,其質量安全直接影響后續乳制品的加工。乳制品中氮含量來源于乳蛋白和非蛋白氮[1],其中正常牛奶中的尿素含量約200～300 mg/L[2],尿素約占乳中非蛋白氮的50%。尿素是蛋白質代謝分解的主要含氮終產物,當其含量超過人體再利用的范疇后,將會對人體造成危害[3]。近年來,一些不法商家為了提高利潤空間,在乳中加入尿素造成蛋白質增多的假象,如2012年印度牛奶出現摻高濃度尿素的牛奶。高濃度尿素會造成泌尿系統排泄障礙,導致身體電解質失衡[4]。因此,有必要排除生乳的摻雜問題,尿素的檢測監督不可或缺。

目前檢測摻入乳中尿素的方法很多,歸納起來主要有以下幾種[5]:直接比色法,通常為基于尿素和試劑所生絡合物結構及數量的比色測定[6-8];間接比色法,即通過酶解法來測試,包括尿素酶比色法[9]和酶電極[10]等方法;而實驗室檢測尿素常見的方法有紅外光譜,高效液相色譜和質譜法。Santos等人[11-12]使用中紅外光譜法對牛奶中的尿素摻雜物進行定性和定量分析;Liu[13]等人采用傅里葉紅外光譜技術可有效檢測奶中的尿素;宋薇[14]等人運用高效液相色譜-熒光檢測器法測定乳及乳粉中尿素;MacMahon[15]和Abernethy[16]等人采用液相色譜串聯質譜法檢測了奶制品中摻的非蛋白氮,可快速定量定性測量摻雜物。雖然比色法價格便宜,但操作繁瑣,所需時間較長,精密度和準確度有限;紅外光譜法、高效液相色譜及質譜法檢測精密度、準確度高,但都存在耗時、費力、昂貴等問題。

電化學方法檢測是通過電極獲得有差異的信號,經處理所采集的數據,可對待測樣品的電極界面信息進行分析[17]。目前在國外的研究中則以自制脲酶生物傳感器檢測牛奶中的尿素居多[18-20],在國內黃贛輝[21]等人運用綜合型傳感器陣列檢測生乳摻雜具有良好的甄別效果,而運用非修飾電極檢測牛奶中的尿素鮮有報道。因此,本實驗以金電極為工作電極,以尿素為生乳摻雜物,采用循環伏安法對生乳摻雜尿素進行檢測,分析電極界面信息,以期得出尿素及其摻入生乳后在電極表面的響應特征。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

生乳 江西陽光乳業股份有限公司長山現代有機牧場提供;H2SO4(AR) 西隴化工股份有限公司;無水乙醇(AR) 上海振興化工一廠;三氯乙酸(AR)、氫氧化鉀(AR) 天津市大茂化學試劑廠;尿素(AR) 天津市永大化學試劑有限公司;γ-Al2O3粉末 上海仙仁儀器儀表有限公司。

CHI440C電化學石英晶體微天平 上海辰華有限公司;PHS-3C pH計 上海雷磁有限公司;KQ-2200DP超聲波清洗器 昆山市超聲清洗儀器有限公司;HH-6電熱恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學儀器廠;TCL-15B高速離心機 上海安亭科學儀器廠;金電極、鉑片電極 上海仙仁儀器儀表有限公司;Ag/AgCl參比電極 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 電極預處理 金電極處理參照石磊[22]等人的方法打磨清洗后,將清洗干凈的電極置于0.5 mol/L H2SO4中活化至CV曲線重合為止(約70周),后于0.01 mol/L[Fe(CN)6]3-/4-中進行循環伏安掃描,若峰電位差在80 mV以下則認為電極符合實驗要求,再用超純水清洗,氮氣吹干保護待用。

1.2.2 樣品數據采集方法 在室溫條件下,以金電極為工作電極,鉑片電極為輔助電極,Ag/AgCl電極為參比電極組裝成測定回路,設置采集參數后置于待測液中,并進行循環伏安法掃描30～60圈后收集相對穩定的響應信號。本次實驗的電位范圍為0～1.4 V,靜置時間為3 min,掃描速率根據實驗測試組目的不同而設置。電化學測定和其他電學測定一樣,多用高靈敏度測定電流和電壓的微小變化,而在測定快速的變化時,往往有電噪音的影響,因此所有實驗測試組均在屏蔽箱中進行。

1.2.3 尿素溶液的制備 用氫氧化鉀分別制備pH為7.00,7.70,7.76,7.78,7.80,7.82的0.1 mol/L的尿素溶液;制備pH為7.0的1.0 mol/L的尿素溶液。

1.2.4 尿素電化學特性的研究 在1.2.2節的條件下,對1.2.3節中的所有樣品逐一進行循環伏安法掃描,研究尿素特有的電化學響應信號。

1.2.4.1 尿素電化學性質的研究 以1、2、3、4、5 mV/s的掃描速率分別對pH為7.0、濃度為0.1和1.0 mol/L的尿素溶液進行循環伏安法研究尿素的電化學響應特征。

1.2.4.2 掃描速率對尿素電化學性質的影響 以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0 mV/s的掃描范圍對pH為7.0、濃度為0.1 mol/L的尿素溶液進行掃描,研究不同掃描速率對其電化學性質的影響。

1.2.4.3 pH對尿素電化學性質的影響 以5 mV/s的掃描速率來對pH分別為7.70、7.76、7.78、7.80、7.82,濃度為0.1 mol/L的尿素溶液進行掃描研究。

1.2.4.4 不同濃度對尿素電化學性質的影響 以1、2、3、4、5 mV/s的掃描速率分別對pH為7.0、濃度為0.1和1.0 mol/L的尿素溶液進行掃描研究尿素電化學反應過程的影響。

1.2.5 摻尿素乳樣品的制備 將從奶站取回冷藏保存的生乳放置至室溫,然后摻雜不同濃度尿素的生乳樣品混合液,分別為0.3、0.6、0.9、1.5、2.5 mol/L,再制備摻雜奶樣品中尿素的檢測樣本。含尿素的生乳樣品檢測樣本制備方法為三個步驟:第一步,從含尿素的生乳中取出4 mL放入45 mL離心管中,用超純水稀釋至13 mL,并加入10%的三氯乙酸溶液2 mL,同時用振蕩器混勻1 min,促使蛋白質凝固;第二步,超聲15 min溶液樣品后,在10000 r/min條件下離心10 min去除脂肪和蛋白質,獲取清澈液;第三步,將清澈液轉移至另一離心管,并用氫氧化鉀溶液調pH至8.0,進一步除去蛋白質,再次離心10 min,最后所得溶液可用于電化學檢測。

1.2.6 摻雜乳中尿素的測定 對1.2.5節中的所有樣品逐一進行循環伏安掃描,掃描速率5 mV/s,其它條件與1.2.2節相同,據此研究摻雜乳中尿素的電化學特性,同時研究摻雜了不同濃度的尿素后對其電化學特性的影響。

1.2.7 檢出限和重現性的測定 將1.2.6測出的含不同濃度尿素摻雜乳樣本的還原峰電流值進行線性回歸分析,根據3N/S計算檢出限。用同一根金電極作為工作電極,在含尿素濃度為0.9 mol/L的3個生乳樣品提取液樣本進行循環伏安掃描,其中,每個樣本測定3次,據此研究該法的重現性和穩定性。

1.2.8 數據統計分析 由于待測液在金電極進行循環伏安法下的響應信號電流數值都相對較小,因此需要對響應電流進行放大后再進行統計分析。從CHI440C中導出原始數據,用MS Office中的Excel組件對數據進行篩分及放大處理,后導入origin 8.0專業作圖軟件重新繪制并作相應分析。

2 結果與討論

2.1尿素的電化學特性

2.1.1 尿素電化學性質的研究 分別對濃度為0.1和1.0 mol/L尿素溶液進行循環伏安法研究。實驗表明:較低的掃描速率下,尿素溶液在金電極上可產生良好的伏安還原峰(見圖1),峰電位為0.210～0.328 V(vs. Ag/AgCl)。

圖1 0.1 mol/L和1.0 mol/L尿素在金電極上不同掃速的還原峰圖Fig.1 The reduction peak of 0.1 mol/L and 1.0 mol/L urea on gold electrode at various scanning注：a～e分別為于0.1 mol/L尿素溶液中1、2、3、4、5 mV/s 的掃描速率；f～j分別為于1.0 mol/L尿素溶液中1、2、3、4、5 mV/s的掃描速率。

2.1.2 掃描速率對尿素電化學性質的影響 通過以不同速率對0.1 mol/L尿素溶液進行循環伏安掃描,結果顯示:尿素的響應特征為單峰,無回掃峰,即尿素得電子,由此產生還原反應。由于峰電位隨掃速增大而負移,峰電流值與ν1/2呈線性關系(見圖2),線性方程為:Ipc=5.7410ν1/2-0.07706,r=0.99784;Ipc=18.9488ν1/2-1.1299,r=0.99086,因此可認為低濃度的尿素溶液在電極上的反應由擴散控制,且為不可逆過程。這個不可逆過程可能是尿素還原后在電極表面上的擴散速度遠大于化學反應速度所導致,故推斷還原態的尿素不能停留在電極表面。

圖2 0.1 mol/L尿素在不同掃描速率條件下的循環伏安圖Fig.2 Cyclic Voltammograms curve of 0.1 mol/L urea at various scanning rates注：a～e的掃描速率分別為1、2、3、4、5 mV/s;f～g的掃描速率分別為7.5、10、15、20、25 mV/s;角圖為峰電流與掃描速率的關系曲線圖。

根據Laviron理論[23],對不可逆反應的峰電位與掃描速度關系應遵循關系式:

Ep=E0+(RT/αnF)[ln(RTKS/αnF)-lnν]

式(1)

式中:E0是標準電勢,R是標準氣體常數(8.314 J·K-1·mol-1),T是Kelvin溫度,α表示電子轉移系數,n為電子轉移數,ks(s-1)代表電化學速率常數,F是法拉第常數(96487 C/mol)。

根據式(1),只需要做Ep與lnν的線性關系(見圖3)即可求αn和ks。由線性方程(Ep=0.33142-0.0652Ln(ν),r=0.99345)的斜率計算得到αn=0.456,截距可計算ks=0.43207±0.0001 s-1。

圖3 Ep-Ln(ν)的線性關系Fig.3 The linear relationships between the potential and scanning rates in logarithmic

2.1.3 pH對尿素電化學性質的影響 在pH為2.4～8.0的體系中進行循環伏安法掃描,實驗結果表明pH為7.70、7.76、7.78、7.80、7.82的酸度范圍內,尿素還原峰的峰形較好,峰電流較大。還原峰電位隨溶液pH的增加而負移,說明還原反應有質子參與。假若電極反應為Oχ+ne+mH+→Red,根據能特斯方程[24-25],對不可逆反應有:

式(2)

以峰電位對pH作圖擬得一條直線,其斜率表明有等數量的電子和質子參與反應,根據尿素的線性回歸方程為E=1.02079-0.10566pH,r=0.9926,可計算出參與還原反應的電子數和質子數均為0.8164,約為1;通過上述的αn=0.456可知,α=0.558。

2.1.4 不同濃度對尿素電化學性質的影響 在pH=7.0的尿素溶液中,實驗了不同濃度的尿素溶液對掃描速率、峰電流的影響,結果表明:當濃度為0.1 mol/L時,Ipc與ν1/2呈線性關系,表明在此時電極過程受擴散控制;當濃度為1.0 mol/L時,還原峰電位仍然隨掃速增大而負移,峰電流也隨之增大,但Ipc既不與ν呈線性關系,也不與ν1/2呈線性關系,這是擴散及吸附都存在的過程。

表1 牛奶中檢測尿素的幾種方法比較Table 1 Comparison of several methods for detection of urea in milk

2.1.5 尿素在金電極上的反應過程 由以上實驗可知,尿素在金電極上的反應電子數和質子數均為1,因此本實驗初步推測尿素在金電極上的反應過程為:尿素經傳質過程到達金電極表面后,C=O雙鍵由于接收了電極給出的電子而成為C-O鍵,因此碳酰胺發生還原反應且反應為不可逆過程,可推斷還原態的物質不能停留在電極表面。

2.2生乳樣品中尿素的測定

2.2.1 樣品中尿素的測定 根據尿素的電化學屬性,金電極在含尿素的溶液中進行CV掃描,可得到尿素的特征曲線。由于純尿素溶液只發生還原反應,因此選擇還原峰的變化趨勢作為實驗的判別依據。本實驗將二次離心后取得的含尿素溶液進行CV 掃描結果與相同條件處理的生乳還原峰曲線比較如圖4。

圖4 從生乳中提取含不同尿素濃度清澈液與生乳的循環伏安曲線Fig.4 Cyclic Voltammograms curve of the clear liquid extracted from raw milk containing urea at different concentrations and raw milk a～e的尿素含量分別為0.3、0.6、0.9、1.5、2.5 mol/L。

通過上圖的數據可知,尿素還原峰電位為0.279～0.301 V之間,均負于生乳(0.550 V)的還原電位,符合尿素特征峰的范圍之內,且峰電位隨摻雜濃度出現微小的負移,峰電流隨摻雜濃度呈線性關系,因此可認為本次摻雜乳中能檢出尿素。

2.2.2 線性范圍與檢出限 在含尿素的生乳樣品中,當尿素濃度為0.3～2.5 mol/L的范圍內,尿素的特征峰在0. 279～0. 301 V之間,且峰電流與尿素的濃度呈線性關系,其線性方程為:Ipc=7.7847+3.3098C/(mol/L),r=0.9945,此實驗生乳樣品中尿素的檢出限為0.171 mol/L。

2.2.3 實驗測定的重現性與穩定性 用同一根金電極作為工作電極,在含尿素0.9 mol/L的生乳樣品提取液中進行循環伏安掃描,結果表明陰極峰電流的平均值為1.1046×10-5A,相對標準偏差為3.827%,說明電極的重現性和穩定性較好。

2.3三氯乙酸對尿素的干擾

將含2.5 mol/L尿素的三氯乙酸溶液同生乳樣本中尿素檢測的方法處理后進行循環伏安掃描研究,結果表明三氯乙酸與尿素混合液的電化學特性曲線和尿素特征曲線無關(見圖5)。

圖5 三氯乙酸-尿素混合液的循環伏安圖Fig.5 Cyclic Voltammograms curve of trichloroacetic acid-urea mixture

2.4此法與其他方法性能比較

通過表1的幾種方法比較發現,在相似范圍內的檢出限中,本文所使用的方法成本較低,預處理簡單,此法可以較好的運用于實際生產線中。

3 結論

本研究以金電極為工作電極,采用循環伏安法檢測尿素及其摻在生乳中的電化學特性,通過實驗結果可知當濃度為0.3～2.5 mol/L的范圍之內,尿素在金電極上發生還原反應,還原峰在0.279～0.301 V(vs. Ag/AgCl)之間,且峰電位隨濃度升高而出現微小的負移,峰電流與尿素的濃度呈正比,根據此峰是否出現及峰電流大小對生乳樣品中尿素進行初步判別并進行量化分析。與其他測定方法比較,此法的樣品預處理簡單、測定速度快、成本低,能較好的運用于實際生產線。

[1]李強強,朱丹,逄秀梅,等.牛乳中摻假外源氮類物質檢測技術研究[J].農產品質量與安全,2015(4):48-53.

[2]杜彥山.牛奶中尿素含量的測定[J].食品研究與開發,2008,29(10):90-93.

[3]翟永信.食品摻偽監測方法[M].北京:北京大學出版社,2002:127-129.

[4]姚俊卿,丁偉.牛奶中摻入尿素、白明膠等非電解質及病

理乳的檢驗方法[J].中國畜牧獸醫,2005,32(7):19-21.

[5]黃報亮,吳清平,鄧金花,等.尿素檢測方法的研究進展及其快速檢測產品現狀[J].光譜實驗室,2013,30(5):2565-2571.

[6]魏峰,馬振山,賈中輝.牛奶中摻入尿素的兩種快速檢測方法[J].食品工程,2006(1):58-60.

[7]范志影,劉宏超,朱超.對二甲氨基苯甲醛為顯色劑分光光度法測定牛奶中尿素[J].分析實驗室,2009,28(Z):313-315.

[8]宋丹,樸仁官,丁毅,等.牛奶中尿素現場快速檢測方法的研究[J].現代科學儀器,2011(4):35-38.

[9]Lima M J,Fernandes R. Enzymatic determination of urea in milk by sequential injection with spectrophotometric and conductometric detection[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,52:6887-6890.

[10]Ali S M U,Ibupoto Z H,Salman S,et al. Selective determination of urea using urease immobilized on ZnO nanowires[J]. Sensors and Actuators B:Chemical,2011,160:637-643.

[11]Santos P,Pereira-Filho E R,Rodriguez-Saona L E. Rapid detection and quantification of milk adulteration using infrared microspectroscopy and chemometrics analysis[J]. Food Chemistry,2013,138:19-24.

[12]Santos P,Pereira-Filho E R,Rodriguez-Saona L E. Application of hand-held and portable infrared spectrometers in bovine milk analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61:1205-1211.

[13]Liu J,Ren J,Liu J M,et al. A new comprehensive index for discriminating adulteration in bovine raw milk[J]. Food Chemistry,2015,172:251-256.

[14]宋薇,張姝,陳曉旭,等.高效液相色譜-熒光檢測器法測定乳和乳粉中尿素含量[J].乳業科學與技術,2014,37(1):23-26.

[15]Macmahon S,Begley T H,Diachenko G W,et al. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of economically motivated adulteration in protein-containing foods[J]. Journal of Chromatography A,2012,1220:101-107.

[16]Grant A,Kerianne H. Rapid detection of economic adulterants in fresh milk by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A,2013,1288:10-20.

[17]田師一. 多頻脈沖電子舌系統構建及應用[D]. 杭州:浙江工商大學,2007.

[18]Laurinavicius V,Razumiene J,Gureviciene V. Bioelectrochemical conversion of urea on carbon black electrode and application[J]. Ieee Sensors Journal,2013,13(6):2209-2231.

[19]Ramesh R,Puhazhendi P,Kumar J,et al. Potentiometric biosensor for determination of urea in milk using immobilized Arthrobacter creatinolyticus urease[J]. Materials Science and Engineering C,2015,49:786-792.

[20]Trivedi U B,Lakshminarayana D,Kothary I L,et al. Potentiometric biosensor for urea determination in milk[J]. Sensors and Actuators B:Chemical,2009,140:260-266.

[21]黃贛輝,石磊,曾祥盛,等.綜合型傳感器陣列對摻雜生乳的識別[J].食品工業科技,2014,35(6):63-72.

[22]石磊,曾祥盛,彭冬英,等.生乳、巴氏乳與酸敗乳的電化學識別研究[J].食品工業科技,2011(12):468-475.

[23]Laviron E. Adsorption,autoinhibition and autocatalysis in polaro-graphy and in linear potential sweep voltammetry[J]. Electroanalytical Chemistry and Interfacial Electrochemistry,1974,52:355-393.

[24]阿倫.J.巴德,拉里.R.福克納.電化學方法原理和應用[M].第2版.北京:化學工業出版社,2005:23-25.

[25]Wang S F,Xu Q. Electrochemical parameters of ethamsylate at multi-walled carbon nanotube modified glassy carbon electrodes[J]. Bioelectrochemistry,2007,70:296-300.

[26]Jianwei Qin,Kuanglin Chao,Moon S. Kim. Simultaneous detection of multiple adulterants in dry milk using macro-scale Raman chemical imaging[J]. Food Chemistry,2013,138:998-1007.

[27]Yongjie Ma,Wenbin Dong,Hongliang Bao,et al. Simultaneous determination of urea and melamine in milk powder by nonlinear chemical fingerprint technique[J]. Food Chemistry,2017,221:898-906.