體外評估十株乳桿菌對免疫細胞活性的影響

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(東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030)

乳酸菌是一種能夠發酵糖類產生大量乳酸的細菌的統稱[1],是人體腸道中最重要的益生菌,它們對維持人體腸道環境的微生態平衡和提高機體免疫力起著關鍵作用[2-5]。乳酸菌表面存在肽聚糖、脂磷壁酸、表層蛋白和其他細胞壁相關多糖[6-7],另外,乳酸菌可以向胞外分泌具有免疫調節作用的物質,如胞外多糖和分泌蛋白。這些表面成分可以參與免疫調節或直接引起免疫應答[8-10]。因此,通過實驗篩選出具有較高免疫活性的乳酸菌,能夠為開發新的微生物資源提供理論支撐。

采用動物實驗的方法可以篩選出具有免疫活性的乳酸菌[11-12],但因其周期較長、耗費較大,實際運用效率不高。而細胞模型能夠彌補動物模型的上述不足,可以較快篩選出具有功能性成分的乳酸菌。免疫細胞是機體免疫系統的重要組成部分,是機體發揮免疫調節作用的主要來源,細胞免疫功能主要是通過免疫細胞本身及其分泌出的細胞因子和抗體來完成的[13]。脾淋巴細胞和巨噬細胞是機體主要的免疫細胞,脾淋巴細胞增殖活性的高低在評價細胞免疫功能強弱中具有重要意義[14],巨噬細胞在機體非特異性和特異性免疫功能中扮演著重要角色,具有吞噬、殺傷、遞呈抗原,分泌生物活性物質以及抑制腫瘤等多種功能[15-18]。因此通過研究乳酸菌與脾淋巴細胞、乳酸菌與巨噬細胞的體外相互作用,可以篩選出具備較高免疫活性的乳酸菌。

本實驗從脾淋巴細胞體外增殖、巨噬細胞吞噬中性紅能力和巨噬細胞能量代謝水平三方面來評價十株乳酸菌對免疫細胞功能和代謝的影響,以獲得具有良好調節免疫細胞活性的乳桿菌,為研究益生菌調節免疫機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

鼠李糖乳桿菌(KLDS 1.0205、KLDS 1.0911、KLDS 1.0912)、植物乳桿菌(KLDS 1.0386、KLDS 1.0344、KLDS 1.0317、KLDS 1.0318)、嗜酸乳桿菌(KLDS 1.1003)、瑞士乳桿菌(KLDS 1.0903)、副干酪乳桿菌(KLDS 1.0351) 均由東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室從內蒙古傳統乳制品中分離純化并保藏；BALB/c小鼠,雌性,清潔級,6～8周齡 北京維通利華實驗動物技術有限公司；鼠房保持飼養環境溫度(23±2) ℃,每天人工燈光照明12 h,標準小鼠飼料喂養,自由飲用蒸餾水；Man-Rogosa-Sharp(MRS)培養基。具體配制方法參照文獻[19]；RPMI-1640培養液 美國Hyclone公司;胎牛血清 Vitrocell公司;刀豆蛋白(ConA)、臺盼藍染色液、中性紅染色液、紅細胞裂解液、Hank’s液 Solarbio公司;CCK-8 日本同仁化學研究所;蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、葡萄糖等均為生化分析純。

DHP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司;LDZF-50KB-II立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫療器械廠;HF90型CO2培養箱 香港力康發展有限公司;Model 680型酶標儀 美國Beckman公司;PL2002型及AL104型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;20～200、100～1000 μL可調定量移液槍 德國Eppendorf公司;96孔培養板 美國NEST公司;AE-30倒置生物顯微鏡 麥克奧迪實業集團有限公司;VD-1320型潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;LD4-2型低速離心機 北京醫用離心機廠。

1.2實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 將實驗菌株以2%的接種量接種至MRS培養基中,37 ℃培養至生長穩定期(16 h),將菌液在4 ℃條件下3000 r/min離心10 min后,用無菌0.01 mol/L、pH7.4的PBS重懸菌沉淀,重復兩次,棄去上清液,用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養液重懸菌沉淀,調整各菌株的菌懸液濃度為108CFU/mL,4 ℃冷藏備用[20]。

1.2.2 小鼠脾淋巴細胞的制備 固定小鼠,摘眼球放血,頸椎脫臼處死小鼠后,將其放入盛有75%乙醇的燒杯中浸泡3～5 min,在超凈臺上沿腹腔中線剪開小鼠胸腔,無菌取出脾臟,將其置于200目不銹鋼網篩,網篩中央浸沒于盛有Hank’s液的平皿中,用無菌注射器芯研磨脾臟組織,用Hank’s液把網上剩余組織吹洗掉,收集脾臟組織懸液于無菌離心管中,1000 r/min離心5 min,棄去上清液,加入2～3 mL紅細胞裂解液到洗過的細胞中,混勻后靜置2～3 min,待紅細胞完全破碎,再以1000 r/min離心5 min后棄上清液,以除去血紅細胞,再用RPMI-1640不完全培養基離心洗滌細胞2次。收集細胞,含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基重懸細胞,細胞懸液用臺盼藍染色后,血球計數板計數,確保活細胞比例不小于95%,計數后用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養基調整脾細胞濃度為1×106個/mL備用[21]。

1.2.3 乳酸菌體外對脾淋巴細胞增殖的影響 在無菌96孔細胞培養板中,設空白調零組(只加培養液200 μL/孔)、陰性對照組(終濃度為1×106個/mL的淋巴細胞懸液180 μL/孔,20 μL培養液/孔)、陽性對照組(淋巴細胞懸液180 μL/孔和20 μL/孔終濃度為5 μg/mL的ConA)、乳酸菌對照組(培養液180 μL/孔和20 μL/孔終濃度為107CFU/mL以及108CFU/mL的待測菌懸液)、實驗組(加淋巴細胞懸液180 μL/孔,20 μL/孔終濃度為107CFU/mL和108CFU/mL待測菌懸液,即使不同乳酸菌與細胞以10∶1、100∶1比例共同培養)[22-23]。所有實驗均重復3次。加樣混勻后,置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中連續培養48 h后,加入新鮮配制成CCK-8溶液20 μL/孔,繼續培養4 h,振蕩混勻,然后用酶標儀在450 nm波長處測定光密度值,根據下列公式計算脾淋巴細胞轉化值和脾淋巴細胞增殖指數(PI)。

脾淋巴細胞轉化值=OD1-OD2

式(1)

式中:OD1為實驗組OD值;OD2為陰性對照組OD值。

式(2)

式中:OD1為實驗組OD值;OD2為陽性對照組OD值;OD3為乳酸菌OD值;PI>1時提示促進增殖;PI<1時提示抑制增殖。

1.2.4 腹腔巨噬細胞吞噬能力測定 腹腔巨噬細胞的制備[24-25]:小鼠眼球放血,頸椎脫白處死后,置于75%乙醇溶液中浸泡5 min以消毒皮膚,暴露出腹膜壁,酒精擦洗腹部后,用無菌注射器抽10 mL Hank’s液,注入腹腔中,輕柔敲打2 min,使腹腔巨噬細胞盡可能多地懸浮在液體中;另取一支注射器抽出腹腔懸液,收集于無菌離心管中,1000 r/min離心5 min,棄上清液;用RPMI-1640完全培養液吹打細胞使其成為單細胞懸液,血球計數板計數,確保活細胞比例不小于95%,調整細胞濃度為1×106個/mL用于實驗。

巨噬細胞吞噬中性紅能力測定[20]:將巨噬細胞接種于96孔板(100 μL/孔),細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養4 h,棄去上清液,貼壁細胞即為巨噬細胞。在每孔重新加入含10%血清的RPMI-1640培養液和終濃度分別為107CFU/mL和108CFU/mL的菌懸液各100 μL,使不同乳酸菌與細胞以10∶1、100∶1比例共同孵育,對照組加等體積的無菌水。細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h,棄去上清液,加入0.1%中性紅染色液100 μL/孔,繼續培養30 min,棄去中性紅染色液,用PBS清洗3次以除去未被吞噬的中性紅溶液,之后加入200 μL/孔細胞裂解液(冰醋酸∶無水乙醇=1∶1,v/v),繼續培養2 h,振蕩混勻,用酶標儀在540 nm處測定吸光值。

1.2.5 腹腔巨噬細胞能量代謝水平的測定 將巨噬細胞接種于96孔板(100 μL/孔),細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養4 h,棄去上清液,貼壁細胞即為巨噬細胞。在每孔重新加入含10%的血清RPMI-1640培養液100 μL,再加入100 μL含不同乳酸菌的菌懸液RPMI-1640完全培養液,使菌懸液終濃度分別為107～108CFU/mL。細胞在37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h,加入20 μL/孔CCK-8溶液,繼續培養4 h,振蕩混勻;然后在酶標儀上450 nm處測定各孔吸光值。結果以OD 值表示腹腔巨噬細胞能量代謝水平[24]。

1.3數據統計

所有實驗均進行3次重復實驗,采用Excel 2007軟件處理實驗數據及制圖,并用統計軟件包SPSS 22對實驗結果進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1十株乳桿菌對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

2.1.1 十株乳桿菌對小鼠脾淋巴細胞轉化值的影響 當乳桿菌與細胞比例為1∶1時,乳桿菌的免疫效果較弱[22],所以本實驗將各乳桿菌與小鼠脾細胞的比例設置為10∶1和100∶1。

淋巴細胞轉化值的高低可以直接反應淋巴細胞活性的強弱,因此淋巴細胞轉化值可以作為測定T淋巴細胞免疫功能的關鍵指標之一[23]。由圖1可知,隨著乳桿菌活菌數的增加,脾淋巴細胞的轉化值也隨之增大,表明十株乳桿菌對脾細胞的增殖具有劑量依賴性。乳桿菌與脾細胞的比例為10∶1和100∶1時,淋巴細胞轉化值均高于陽性對照組且差異顯著(p<0.05)。組內比較結果表明,當乳桿菌活菌數與細胞的比例為10∶1時,植物乳桿菌KLDS 1.0344和KLDS 1.0318的增殖效果顯著高于其他菌株(p<0.05),當乳桿菌活菌數與細胞的比例為100∶1時,各組淋巴細胞轉化值均有所增加,但以植物乳桿菌KLDS 1.0318的增殖效果最好。

圖1 十株乳桿菌對小鼠脾淋巴細胞轉化值的影響Fig.1 Effect of ten lactobacillus strains on the transformation of spleen lymphocytes in mice注:不同小寫字母代表各菌株差異性不同(p<0.05),字母相同代表無差異(p>0.05)，圖2～圖4同。

圖2 十株乳桿菌對脾淋巴細胞增殖指數(PI)的影響Fig.2 Effect of ten lactobacillus strains on proliferation index(PI)of spleen lymphocytes

2.1.2 十株乳桿菌對小鼠脾淋巴細胞增殖指數的影響 由圖2中數據可以看出:當各乳桿菌與脾細胞以100∶1的比例共同孵育時,除鼠李糖乳桿菌KLDS 1.0912和副干酪乳桿菌KLDS 1.0351外,其它乳桿菌的增殖指數均大于1,即能直接促使脾淋巴細胞的增殖,從而可以提高機體脾淋巴細胞的免疫應答能力。當不同乳桿菌與脾細胞的比例為10∶1時,除了植物乳桿菌KLDS 1.0318外,其它菌株的PI值均小于1,說明植物乳桿菌KLDS 1.0318具有更好提高脾淋巴細胞增殖的能力。

2.2十株乳桿菌對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響

本研究采用巨噬細胞吞噬中性紅的方法,評估十株乳桿菌對巨噬細胞吞噬作用的影響,結果如圖3所示。由圖中數據可以看出:當乳桿菌活菌數與細胞的比例為10∶1時,十株乳桿菌均可以明顯提高巨噬細胞的吞噬作用(p<0.05)。當乳桿菌活菌數與細胞以100∶1的比例共同孵育時,巨噬細胞的吞噬作用比10∶1時增強，且植物乳桿菌KLDS 1.0318對于巨噬細胞吞噬中心紅能力的誘導作用最強,說明該菌株能夠增強巨噬細胞吞噬活性,從而可以參與到機體非特異性免疫反應當中。

圖3 十株乳桿菌對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅能力的影響Fig.3 Effect of ten lactobacillus strains on phagocytosis of neutral red in abdominal macrophages of mice

圖4 十株乳桿菌對小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平的影響Fig.4 Effect of ten lactobacillus strains on energy metabolism of abdominal macrophages in mice

2.3十株乳桿菌對小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平的影響

由圖4數據結果表明,相較于空白組,十株乳桿菌的兩個劑量組對小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平均有不同程度的提高,且差異顯著(p<0.05)。當乳桿菌活菌數與細胞的比例為10∶1時,植物乳桿菌KLDS 1.0318對小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平的影響最明顯。當乳桿菌活菌數與細胞的比例為100∶1時,各組巨噬細胞能量代謝水平隨活菌數的增加均有不同程度的增加。

3 討論

3.1乳酸菌對免疫細胞活性的影響

因為動物實驗周期長、耗費大,所以采用動物實驗篩選具有免疫活性的乳酸菌效率不高[12]。免疫細胞是參與免疫應答或與免疫應答相關的細胞,包括淋巴細胞和單核巨噬細胞等。根據淋巴細胞的發育部位、表面、抗原、受體及功能等不同,可將淋巴細胞分為T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)和殺傷細胞(K細胞)。脾臟是T淋巴細胞定居繁殖、接受抗原激活,產生效應細胞行使免疫功能的重要場所[24]。T淋巴細胞參與細胞免疫包括直接與靶細胞特異性結合破壞細胞膜殺傷靶細胞和釋放淋巴因子使免疫效應擴大兩種方式,淋巴細胞增殖實驗是檢測淋巴細胞免疫反應的有效方法之一[27-28]。王婷婷等[29]研究了三株乳桿菌對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響,結果表明瑞士乳桿菌KLDS 1.8701對脾淋巴細胞的增殖效果最好。本實驗利用CCK-8法測定乳桿菌對T淋巴細胞增殖活性的影響,結果表明,十株乳桿菌均可以不同程度提高T淋巴細胞的增殖轉化能力,其中植物乳桿菌KLDS 1.0318對脾淋巴的調節活性最高,說明了乳桿菌可以改變T淋巴細胞活性,誘導其增殖和分化,從而增強機體免疫功能。單核吞噬細胞包括分散在全身各器官組織中的巨噬細胞、單核細胞及幼稚單核細胞。單核細胞由骨髓中的單核細胞前體發育分化而成,在血液中停留12～24 h,然后進入結締組織發育成熟為巨噬細胞。巨噬細胞表面有較多的MHCII類分子,MHCII類分子可以反應細胞外部情況,如果組織中有細菌侵入,巨噬細胞進行吞食后,通過MHC提示把細菌碎片給輔助T細胞,啟動機體免疫反應。巨噬細胞表面還有MHCI類分子,MHCI類分子可以提供細胞內狀況,當細胞遭受病毒感染,病毒外膜碎片的氨基酸鏈透過MHC提示,可以提供殺手CD8+T細胞等辨識,以進行撲殺[30]。通常情況下,巨噬細胞處于休眠狀態,吞噬作用不強。但巨噬細胞被免疫增強劑激活后,可以抑制腫瘤細胞的生長、增強吞噬作用和胞飲作用[31]。有研究表明巨噬細胞參與機體先天免疫反應,它和中性粒細胞作為宿主防御的第一道防線,在宿主防止微生物入侵中發揮重要作用[32]。本研究通過巨噬細胞吞噬中性紅實驗得出十株乳桿菌均可以明顯提高巨噬細胞的吞噬能力。此外,本研究還利用CCK-8法測定乳桿菌對巨噬細胞能量代謝水平的影響,結果顯示十株乳桿菌均可以不同程度刺激小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平的提高,其中植物乳桿菌KLDS 1.0318對于提高巨噬細胞吞噬活性顯著高于其余菌株。

3.2乳酸菌劑量的選擇

調節免疫活性需要的乳酸菌濃度一直備受關注。李艾黎[22]等將乳桿菌的劑量調整至高、中、低三個濃度,發現不論是活性乳桿菌還是熱致死乳桿菌,其對小鼠脾臟細胞的增殖作用都隨菌濃度的增加而提高,表現出劑量依賴性。活性和熱致死乳桿菌劑量為107CFU/mL(即細菌與細胞的比例為10∶1)的效果最為明顯(p<0.05),且活菌制劑的免疫調節作用優于熱致死菌體(p<0.05)。而本實驗將細菌與細胞的比例提高到了100∶1,結果表明了在此條件下,十株乳桿菌對脾淋巴細胞增殖活性作用和對巨噬細胞吞噬作用以及對巨噬細胞能量代謝水平的影響相較于細菌與細胞的比例為10∶1條件下能夠更好表現出菌株差異性,但具體的有效劑量可能會因為多種因素的影響而存在較大差異,包括菌種差異、菌的活性、個體差異、生理特性、其他膳食因素等,因此尚待進一步的研究。

3.3乳酸菌免疫調節活性成分

乳酸菌表面有肽聚糖、胞壁磷壁酸、脂磷壁酸、表層蛋白以及細胞壁相關多糖。此外,乳酸菌還可以向細胞外分泌一些具有免疫調節活性的物質,如胞外多糖和其他分泌蛋白[33]。這些表面成分參與免疫調節或直接引起免疫應答,因而構成了乳桿菌發揮益生功效的物質基礎。多糖類的成分可以激活巨噬細胞,增強其吞噬功能,分泌細胞因子,幫助機體抵抗病原菌與病毒的感染[34]。另外,乳酸菌的免疫調節活性具有一定的菌株特異性。Kimoto等[35]研究了16株乳酸乳球菌的免疫調節活性,其中有6株球菌能誘導細胞產生IL-12、IL-6和TNF-α。RYU等[36]認為革蘭氏陽性菌免疫刺激作用強弱的差別在于其細胞壁上的脂磷壁酸結構不同,因此造成了對TOLL樣受體的激活能力有差異。也有人認為是乳酸菌細胞壁表面其他成分,如疏水性、表層蛋白、胞外多糖等對免疫調節發揮著關鍵作用[37]。本研究以完整菌體與免疫細胞共同孵育,結果顯示在細菌與細胞的比例為100∶1條件下,十株乳桿菌對小鼠脾淋巴細胞的增殖具有不同程度的促進作用,同時增強了巨噬細胞吞噬活性及其能量代謝水平,其中植物乳桿菌KLDS 1.0318的免疫調節活性最高,說明該菌具有調節動物機體免疫功能的潛力。但具體的有效成分及其對免疫細胞因子的影響還有待研究。

4 結論

十株乳桿菌均可以在不同程度上誘導小鼠脾淋巴細胞體外增殖,其中植物乳桿菌KLDS 1.0318對脾淋巴細胞的調節活性較高,在乳桿菌活菌數為107CFU/mL和108CFU/mL時,其增殖指數均大于1,顯著高于其余菌株,表現出更強的刺激增殖作用。十株乳桿菌均可在一定程度上提高巨噬細胞活性,當乳桿菌活菌數為108CFU/mL時,十株乳桿菌誘導巨噬細胞吞噬中性紅能力與空白對照組有顯著性差異(p<0.05),表明它們能夠顯著提高巨噬細胞吞噬能力。當乳桿菌活菌數為107CFU/mL和108CFU/mL時,相較于空白對照組,十株乳桿菌均可以刺激小鼠腹腔巨噬細胞能量代謝水平的提高,且差異顯著(p<0.05)。其中植物乳桿菌KLDS 1.0318表現出了較強的調節巨噬細胞活性的能力。

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