乳鐵蛋白水解物修飾物的分離純化及其抗大腸桿菌活性

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(1.遼寧大學,遼寧大學輕型產業學院,遼寧沈陽 110000;2.乳品科學教育部重點實驗室,東北農業大學,黑龍江哈爾濱 150030)

食源性抗菌肽具有抑菌活性好、安全無毒副作用的優點,是開發綠色健康新型食品防腐劑的重要候選者。乳鐵蛋白是一種鐵結合糖蛋白,其來源廣,存在于許多外分泌物中,包括牛奶、眼淚、唾液等[1]。已有研究證實,乳鐵蛋白經過水解抑菌活性有所提高,并將人乳來源的水解物命名為lactoferricin H,牛乳來源的水解物命名為lactoferricin B(LfcinB)[2]。經胃蛋白酶水解的乳鐵蛋白,能夠釋放出具有生理和藥理作用的生物活性肽,包括抗菌肽[3]。因此,乳鐵蛋白抗菌肽在研究新型食品防腐劑、新型抗生素、防止食品腐敗等方面有著巨大的應用潛力[1]。

類蛋白反應是蛋白常規酶解的逆過程,在酶的作用下高質量濃度的蛋白水解產物形成不溶于水的產物和凝膠型產物,這些產物稱為類蛋白物[4]。類蛋白反應能夠使多肽鏈和氨基酸殘基發生變化,引起多肽分子組成和空間結構發生變化,進而生物活性發生改變。近年來,對類蛋白物的修飾也有了大量研究,Zhao[5]等人的研究結果表明,酪蛋白水解物的類蛋白反應修飾產物,在抗氧化活性方面有顯著提高。孫玥[6]等人研究發現,乳鐵蛋白水解物(LHS)利用類蛋白反應導入色氨酸和精氨酸后抑菌活性提高,且色氨酸修飾物抑菌活性高于精氨酸修飾物抑菌活性。

分離純化技術已成為獲得高活性抗菌肽的常用方法之一。J Li[7]等利用凝膠過濾色譜和高效液相色譜高效分離純化出了一種蛙皮膚粘液中的抗菌肽。李暢[8]等利用鹽析和凝膠過濾色譜對乳鐵蛋白水解物進行了分離純化,得到抑菌活性提高的抗菌肽。目前,還沒有對乳鐵蛋白水解物的類蛋白修飾產物進行分離純化方面的研究。本文在前期研究的基礎上,對乳鐵蛋白水解物色氨酸修飾產物采用葡聚糖凝膠過濾色譜G-25進行分離純化,測定抑菌活性后利用高壓液相色譜分析純化產物的純度,以期為高活性高純度抗菌肽的制備提供參考,為食品防腐劑等的研究開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

乳鐵蛋白(純度97%) 新西蘭Westland Milk Products公司;色氨酸甲酯鹽酸鹽 阿拉丁試劑股份有限公司;胃蛋白酶 中國惠世生化試劑有限公司;大腸桿菌 東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室提供;牛肉膏 北京奧博星生物技術有限責任公司;水解酪蛋白 Sigma公司;可溶性淀粉 天津市東麗區天大化學試劑廠;葡聚糖凝膠(Gephadex)G-25 Summus公司;超純娃哈哈飲用純凈水 娃哈哈集團有限公司;三氟乙酸 天津市博迪化工有限公司;乙腈(色譜純) Dikma公司。

DELTA 320型pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Alpha 1-4中型凍干機 德國Matin Christ公司;HZQ-F160全溫振蕩培養箱 哈爾濱東聯電子技術開發有限公司;BIO-RAD 680酶標儀 美國BIO-RAD公司;WD-9405B型水平搖床 北京市六一儀器廠;手提式滅菌鍋 上海醫用核子儀器廠;ZHOH-1109無菌操作臺 上海毅聽實驗室設備有限公司;1.6×70 cm層析柱 上海華美實驗儀器廠;抽濾裝置 津騰科技儀器有限公司;KQ3200DE型數控超聲波清洗器 杭州機電五廠;蛋白質純化儀 General Electric Company;C18色譜柱(250 mm×10 mm;i.d.5 μm) 臺灣YMC公司;RP-HPLC系統 Waters公司。

1.2實驗方法

1.2.1 菌株培養 取保存于甘油中的大腸桿菌,接種于MH培養基中。37 ℃條件下振蕩培養活化菌種,使菌液充分恢復活力。最后用MH培養基稀釋至菌密度為105CFU/mL,用于后續的抑菌性測定實驗。以上步驟均在無菌操作臺上進行。

MH培養基制備方法為:牛肉膏2.00 g,水解酪蛋白17.50 g,可溶性淀粉1.50 g,溶于1.00 L水中,調節pH至7.40,溶解后高壓滅菌鍋中滅菌(121 ℃,15 min)備用。

1.2.2 乳鐵蛋白水解物及其色氨酸修飾物的制備 乳鐵蛋白的水解條件為:乳鐵蛋白底物濃度5%(w/v),pH(2.50±0.10),胃蛋白酶活力與乳鐵蛋白濃度比(E/S)是1.00 kU/g,37 ℃水浴條件下水解時間為4 h。反應結束后80 ℃滅酶15 min,pH調至(5.00±0.10)。再4 ℃冷凍離心(17000×g)15 min,收集上清,冷凍干燥保存備用[7]。

Trp修飾產物的制備條件為:LHs濃度為40%(w/w),pH調至5.00,色氨酸游離氨基含量與總游離氨基比為0.70 mol/mol,胃蛋白酶活力與LHS濃度比為2.00 kU/g,反應溫度37 ℃,反應時間12 h。反應結束后80 ℃滅酶15 min,儲存于-20 ℃并冷凍干燥保存備用[6]。

1.2.3 葡聚糖凝膠Sephadex G-25過濾色譜分離純化 配制樣品LHS及其Trp修飾物濃度為20 mg/mL,0.45 μm濾膜過濾除菌。超純水作為洗脫液,使用前超聲脫氣30 min,超聲功率為360 W,備用。將Sephadex G-25凝膠過濾色譜柱與蛋白純化儀聯用,流速0.50 mL/min。平衡色譜柱至基線水平[8]。平衡柱子結束后上樣,上樣量1.00 mL,上樣濃度20 mg/mL,洗脫速度0.50 mL/min,同時以280 nm波長的紫外檢測儀檢測,記錄洗脫圖譜,收集各洗脫峰。將各收集峰的洗脫液于-20 ℃預凍并冷凍干燥。各洗脫組分用微量稀釋法分別測定其抑菌性,大量收集抑菌活性最好的出峰產物用于后續實驗。

1.2.4 蛋白酶活力測定 采用福林法,參考SB/T 10317-1999[9]。

1.2.5 蛋白質含量的測定 采用凱氏定氮法,參考GB/T 5009.5-2016[10]。

1.2.6 游離氨基含量的測定 采用鄰苯二甲醛(OPA)法,測定游離氨基含量[11]。

1.2.7 蛋白水解度的計算 蛋白質水解度(DH)是指每克水解的蛋白中裂解的肽鍵毫摩爾數與水解前蛋白中全部肽鍵毫摩爾數的百分比。蛋白水解度的計算式如下:

式中:X1-蛋白水解后游離氨基含量(mmol/g);X2-蛋白水解前游離氨基含量(mmol/g);8.658-乳鐵蛋白中的肽鍵含量(mmol/g)。

1.2.8 微量稀釋法測定抑菌性 配制適宜濃度的抑菌物質,并用0.22 μm的醋酸纖維素膜過濾除菌。在96孔板中對抑菌物質進行梯度稀釋,得到不同濃度的抑菌物質孔,保證每孔抑菌物質添加量為50 μL。再加入50 μL稀釋好的菌液,于37 ℃培養箱中孵育24 h。酶標儀測定其在630 nm處的吸光值記為OD0;將抑菌物質替換為無菌生理鹽水,相同條件下孵育,測定630 nm處的吸光值為OD1;加入50 μL的無菌生理鹽水和50 μL的MH培養基溶液孔,相同條件下孵育,測定630 nm處的吸光值為OD2[13]。每組實驗設5個平行孔,重復3次。抑菌率計算公式如下:

式中:OD0-添加抑菌物質的大腸桿菌生長體系吸光值;OD1-未添加抑菌物質的大腸桿菌生長體系吸光值;OD2-培養基和無菌生理鹽水的吸光值。

1.2.9 反相高效液相色譜(RP-HPLC)測定 分析將凝膠過濾色譜分離得到的活性較好的出峰產物配制成濃度為3 mg/mL,0.45 μm濾膜過濾除菌。A液0.1% TFA和B液色譜級乙腈作為流動相進行梯度洗脫,使用前真空抽濾去除雜質灰塵,超聲脫氣30 min,備用。RP-HPLC分析的流動相洗脫分為以下四個梯度:0～15 min時,A液90%,B液10%;15～20 min時,A液75%,B液25%;20～29 min時,B液100%;29～60 min時,A液90%,B液10%。上樣體積15 μL,上樣濃度3.00 mg/mL,檢測流速為0.50 mL/min,同時以280 nm波長的紫外檢測儀檢測,記錄檢測圖譜[13]。

1.3數據處理

采用Origin 8.0和Word 2010軟件作圖,實驗數據均為多次重復實驗結果的平均值,結果以平均值±標準偏差表示。采用SPSS17.0軟件中的單因素方差分析及Duncan多重比較分析進行數據統計,p<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1葡聚糖凝膠過濾色譜G-25分離純化

采用葡聚糖凝膠過濾色譜G-25對LHS進行分離純化,分離純化圖譜結果,如圖1。可以看出,LHS經過分離純化得到兩種出峰產物,峰1和峰2。洗脫體積約為34 mL,洗脫時間約78 min時出現峰1,洗脫體積約為75 mL,洗脫時間約150 min時,出現峰2。峰1顯著高于峰2,分別收集峰1和峰2組分,于-20 ℃預凍并冷凍干燥處理測定其抑菌性。

圖1 LHS水解物的葡聚糖凝膠過濾色譜圖Fig.1 Sephadex gel filtration chromatogram of lactoferrin hydrolysate

采用葡聚糖凝膠過濾色譜G-25對Trp修飾產物進行分離純化,分離純化圖譜結果,如圖2。可以看出,Trp修飾產物經過分離純化得到三種出峰產物峰1、峰2和峰3。洗脫體積約為45 mL,洗脫時間約為90 min時出現峰1組分,峰1顯著高于峰2和峰3。分別收集峰1、峰2和峰3組分,于-20 ℃預凍并冷凍干燥處理測定其抑菌性。

圖2 Trp修飾產物的葡聚糖凝膠過濾色譜圖Fig.2 Sephadex gel filtration chromatogram of tryptophan modifier

這五種出峰產物的抑菌活性比較結果,如表1。可以看出,LHS純化峰1產物的抑菌活性為41.42%,其對應的峰2產物無抑菌活性。Trp修飾物純化峰1產物的抑菌活性較其對應的峰2、峰3產物抑菌活性也有顯著提高(p<0.05)。Trp修飾物純化峰2產物與其峰3產物抑菌活性無顯著性差異(p>0.05)。可見兩者抑菌活性最高的純化峰均為峰1,收集抑菌活性最高的純化峰1產物進行后續實驗。

表1 不同出峰產物的蛋白質含量及抑菌活性Table 1 Antibacterial activity and protein content of peak products

注:-表示未檢測出抑菌活性,表中不同上標字母代表顯著性差異(p<0.05)。

2.2各級產物蛋白含量及抑菌活性比較

乳鐵蛋白經胃蛋白酶水解生成多肽,利用游離氨基的減少量可以判斷類蛋白反應的發生。采用OPA法得出游離氨基的減少量為45.00 μmol/g,乳鐵蛋白水解物的水解度為6.18%。采用福林法,測定胃蛋白酶活力為16.9 kU/g。采用凱氏定氮法測定LHS、LHS純化峰1產物、Trp修飾物、Trp純化峰1產物的蛋白質含量分別為82.01%、96.98%、78.13%和98.63%。LHS純化峰1產物和Trp純化峰1產物的蛋白質含量顯著高于其對應未純化產物(p<0.05)。

表2 兩種濃度下產物抑菌率Table 2 The antibacterial rates of products at two concentrations

注:-表示未檢測出抑菌活性,表中同一列數據不同上標字母代表顯著性差異(p<0.05)。

由于純化產物上樣量較低收集量相對較少,前期實驗結果表明LHS的最小抑菌濃度為200 mg/mL,LHS純化峰1產物的最小抑菌濃度為100 mg/mL。因此純化產物只測定在100 mg/mL濃度下的抑菌活性,非蛋白純化產物測定其在100 mg/mL和200 mg/mL兩種濃度下的抑菌活性。比較100 mg/mL和200 mg/mL兩種濃度下各級產物的抑菌活性,結果見表2。

可以看出,濃度100 mg/mL時,LHS無抑菌活性,Trp純化峰1產物抑菌活性顯著高于Trp修飾產物,Trp修飾產物抑菌活性顯著高于LHS純化峰1產物(p<0.05)。峰1產物純化后抗大腸桿菌活性高可能是由于純化后所得峰1的蛋白質含量高,所含抗菌肽純度高導致。各級產物的抑菌效果為LHS純化峰1產物

2.3反相高效液相色譜分析

收集活性較高的LHS-1和Trp-1進行進一步的HPLC分析。采用A液0.10% TFA和B液色譜級乙腈作為流動相進行梯度洗脫,得到LHS-1的色譜圖檢測結果,如圖3。Trp-1的色譜圖檢測結果,如圖4。可以看出,LHS純化峰1產物經過C18色譜柱后得到多個吸收峰,出峰時間在21～41 min之間,該物質有待于進一步分離純化。Trp修飾物純化峰1產物經過C18色譜柱后得到單一峰,出峰時間在19 min處,可見該產物的純度相對較高。兩種物質出峰時間不同,進一步驗證了類蛋白修飾反應的發生。

圖3 LHS-1的RP-HPLC分離色譜圖Fig.3 RP-HPLC chromatogram of LHS-1 separation

圖4 Trp-1的RP-HPLC分離色譜圖Fig.4 RP-HPLC chromatogram of Trp-1 separation

3 結論

本研究利用凝膠過濾色譜對乳鐵蛋白水解物的類蛋白色氨酸修飾物分離純化,得到了純度相對較高且抗大腸桿菌活性提高的新型抗菌肽。通過對LHS和其Trp修飾產物進行蛋白純化儀分離純化,收集各出峰組分進行抗大腸桿菌活性測定,得到峰1為最高抑菌活性峰。對峰1出峰產物進一步利用RP-HPLC分析,LHS-1的RP-HPLC檢測得到多個吸收峰,有待于進一步分離。Trp-1的RP-HPLC檢測得到單一峰,說明所得抗大腸桿菌肽的純度相對較高。兩種物質出峰時間不同,進一步驗證了類蛋白修飾反應的發生。色氨酸修飾物對大腸桿菌的抑菌率較未修飾前提高了45.41%,色氨酸修飾產物經過純化后對大腸桿菌的抑菌率較未純化前提高了29.69%。本研究通過對類蛋白修飾物的分離純化得到了純度相對較高、抑菌活性提高的抗菌肽,為一種抗大腸桿菌肽的制備提供了新思路,為食品防腐劑的研發提供了新原料。

[1]Rybarczyk J,Kieckens E,Vanrompay D,et al.Invitroandinvivostudies on the antimicrobial effect of lactoferrin againstEscherichiacoliO157∶H7[J]. Veterinary Microbiology,2016.

[2]RuizgimeéNez P,Burguete M C,CastelloRuiz M,et al. Bovine lactoferrin pepsin hydrolysate exerts inhibitory effect on angiotensin I-converting enzyme-dependent vasoconstriction[J]. International Dairy Journal,2007,17(10):1212-1215.

[3]Ruiz-Giménez P,Salom J B,Marcos J F,et al. Antihypertensive effect of a bovine lactoferrin pepsin hydrolysate:Identification of novel active peptides[J]. Food Chemistry,2012,131(1):266-273.

[4]Zhao X H,Li Y Y. An approach to improve ACE-inhibitory activity of casein hydrolysates with plastein reaction catalyzed by Alcalase.[J]. European Food Research and Technology,2009,229(5):795-805.

[5]Zhao X H,Dan W,Li T J. Preparation and radical scavenging activity of papain-catalyzed casein plasteins.[J]. Dairy Science &

Technology,2010,90(5):521-535.

[6]孫玥,李鐵晶.乳鐵蛋白水解物的制備及其修飾物的抑菌作用研究[D].哈爾濱:東北農業大學,2014.

[7]Li J,Xu X C,Zhou W,et al. Anti-infection peptidomics of amphibian skin.[J]. Molecular & Cellular Proteomics,2007,6(5):882-894.

[8]李暢,李鐵晶. 乳鐵蛋白水解物中抗菌肽的分離與純化[D].哈爾濱:東北農業大學,2015.

[9]SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》.

[10]GB/T 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》.

[11]Spellman D,Mcevoy E,O’Cuinn G,et al. Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein:Comparison of the TNBS,OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis[J]. International Dairy Journal,2003,13(6):447-453.

[12]Redwan E M,El-Baky N A,Al-Hejin A M,et al. Significant antibacterial activity and synergistic effects of camel lactoferrin with antibiotics against methicillin-resistant Staphylococcus aureus,(MRSA)[J]. Research in Microbiology,2016,167(6):480-491.

[13]Mishra B,Leishangthem G D,Gill K,et al. A novel antimicrobial peptide derived from modified N-terminal domain of bovine lactoferrin:Design,synthesis,activity against multidrug-resistant bacteria and Candida[J]. BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-Biomembranes,2013,1828(2):677-686.