生防菌株洋蔥伯克氏菌對草莓果實采后病害控制及安全性評價

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(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006;2.山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所,山西太原 030031)

微生物防治方法由于其無殘留、不產生耐藥性等優點,被認為是最有可能替代化學殺菌劑的方法之一[1-2]。洋蔥伯克氏菌(Burkholderiacepacia)在20世紀50年代作為一種植物病原菌被人們認識,Burkholder首次報道該菌可引起洋蔥鱗莖腐爛,稱為洋蔥假單胞菌(Pseudomonascepacia)[3]。洋蔥伯克氏菌廣泛存在于土壤、水和植物根際。農業領域中,洋蔥伯克氏菌具有生物防治、生物降解以及促進植物生長等多種功能,在農業方面有廣泛應用前景及生物防范功效[4-6]。

洋蔥伯克氏菌是一類基因型不同、表型相近的菌株復合群,目前已發現17個基因型,稱為洋蔥伯克氏菌復合群(Burkholderiacepaciacomplex,簡稱Bcc)[7-8]。Bcc能防治多種植物的真菌性病害,如由腐霉(Pythiumspp.)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)和鐮刀菌(Fusariumspp.)引起的植物猝倒病[9];Parke J L[9]等發現洋蔥伯克氏菌對梨青霉病(Penicilliumexpansum)、蘋果灰霉病(Botrytiscinerea)和桃褐腐(Sclerotinialaxa)以及柑橘各種采后病害也具有生防效果;De Costa等[10]從香蕉表面也分離到伯克氏菌,可有效防治香蕉炭疽病(Colletotrichummusae)的發生。本實驗室從杏果實分離得到基因型為Burkholderiacontaminans的洋蔥伯克氏菌,初步研究發現[11]該菌株可以降低玫瑰香葡萄采后腐爛率。Bcc復合群中的一些基因型曾作為人體的條件致病菌[12-14],在英國、加拿大等囊性肺纖維化(CF)病人中大流行,引起敗血癥、肺炎、心內膜炎和傷口感染等[15-16],因此研究該類生防菌株的安全性也十分必要。本文一方面研究洋蔥伯克氏菌對草莓果實采后病害的防治效果,另一方面進行動物實驗,進一步測定其安全性,旨在為生防菌洋蔥伯克氏菌的開發利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

洋蔥伯克氏菌(B.contaminans) 本實驗室制備;灰葡萄孢霉(Botrytiscinerea) 分離于自然發病的草莓果實;草莓果實 采自山西省晉中市東陽鎮大棚內,早8點前采收,品種為“紅顏”,采摘當天運回實驗室預冷并貯藏于0 ℃冷庫中;Wistar大鼠(體重180～220 g,動檢號:070101)、家兔(體重2.5～3.0 kg)、豚鼠(體重為200～250 g) 山西醫科大學實驗動物中心提供。

LS-B50L-I型壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司;BSD-WF2200振蕩培養箱 上海博訊實業有限公司;HDL型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;DHP-9272型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 生防菌B-1發酵液的制備 生防菌洋蔥伯克氏菌B.contaminansB-1由本實驗室分離于杏果實表面,進行分子和生理生化鑒定。將保存于-80 ℃的B-1在PDA固體培養基活化培養后,挑取單菌落于50/250 mL LB液體培養基中28 ℃ 200 r/min搖瓶培養。

1.2.2 孢子懸浮液的制備 由發病果實分離的灰葡萄孢霉于PDA平板26 ℃培養5～7 d后,刮取分生孢子,采用血球計數法用無菌水配制成1.0×105孢子/mL的懸浮液。

1.2.3 草莓果實的預處理 自然腐爛法所用草莓果實為同一成熟度及顏色大小一致的果實,無病蟲害及機械損傷。傷口接種法預處理:將同一大小顏色的健康草莓果實置于2%的次氯酸納溶液中浸泡2 min,無菌風吹干放于滅菌的塑料筐中,用滅菌針在草莓腰部刺直徑5 mm深度3 mm的傷口,每個果實刺1個傷口。

1.2.4 不同發酵時間對草莓果實采后病害的抑制 將經過6、12、24、48、72、96 h搖瓶培養的發酵液分別浸泡挑好的無傷口的草莓果實(CK處理不浸泡,陰性對照用無菌水浸泡),浸泡時間為3 min,無菌風吹干外套保鮮膜,于6 ℃下貯藏20 d。重復上述操作,16 ℃下貯藏9 d。每次處理0.5 kg的草莓果實,實驗重復3次。

參考李靜[17],根據果實腐爛等級,計算果實腐爛指數,用果實腐爛指數代表果實采后病害的程度。果實腐爛程度分5個等級,分級標準為:0級:果實完好,無任何腐爛;1級:果實表面現輕微斑點,腐爛面積小于1/3;2級:果實腐爛面積約果實表面的1/3～1/2;3級:果實腐爛部位超過果面1/2,但尚有一定硬度;4級:果實整體完全潰爛。腐爛指數計算公式如下:

果實腐爛指數(%)=[∑(各級腐爛果個數×腐爛級別)]/(最高腐爛級別×果實總個數)×100

1.2.5 不同處理方式對草莓果實采后病害的抑制 將1.2.1發酵24 h的發酵液置于小型噴霧器中,對放置于筐中挑好的無傷口草莓果實,進行均勻的噴淋實驗,噴至表面果實均有液滴覆蓋。另取相同的發酵液對草莓果實進行浸泡實驗,分別浸泡0.5、1、2、3、4 min(CK不浸泡),噴淋或浸泡后無菌風吹干,外套保鮮袋,放置16 ℃貯藏9 d,參考1.2.4計算草莓果實的腐爛指數。每次處理0.5 kg的草莓果實,實驗重復3次。

1.2.6 生防菌不同處理液對草莓采后病害的抑制 將1.2.1發酵24 h的發酵液分別進行如下處理。A:發酵原液;B:稀釋5倍發酵液;C:稀釋10倍發酵液;D:菌懸液(發酵液離心后,菌株用無菌水稀釋至原體積);E:5倍菌懸液(同上,菌體稀釋5倍);F:10倍菌懸液(同上,菌體稀釋10倍);G:上清液;H:稀釋5倍上清液;I:稀釋10倍上清液。

將挑好的無傷口的草莓果實置于上述不同處理液中浸泡3 min,CK用無菌蒸餾水浸泡3 min。處理后用無菌風吹干,外套保鮮袋,放置16 ℃下貯藏9 d,參考1.2.4計算果實草莓的腐爛指數。每次處理0.5 kg的草莓果實,實驗重復三次。

1.2.7 生防菌不同處理液對草莓采后灰霉病的影響 發酵液A、B、C、D、E的處理同1.2.6的A、B、C、D、G。F:熱殺死液(發酵液經過121 ℃下滅菌15 min)。在草莓果實傷口處加不同的生防菌菌處理液40 μL,CK加無菌蒸餾水。無菌風吹2 h后,于每個傷口再加15 μL孢子懸浮液,外套保鮮袋,放置16 ℃下貯藏5 d。每次處理0.5 kg的草莓果實,實驗重復3次。

參考趙妍[18]統計果實發病率及病斑直徑。果實發病率為被感染的傷口數與傷口總數的百分比表示,病斑直徑為用十字交叉法測量病斑最長值和最短值,取其平均值為腐爛部位的直徑。

1.2.8 動物實驗方法 根據《農藥登記毒理學實驗方法》[19]的標準,對該生防菌株進行相關實驗,包括大鼠急性經口毒性實驗、皮膚刺激實驗、眼刺激實驗和皮膚變態(致敏)實驗。動物采用標準飼料喂食,自由飲水的方式。

1.2.8.1 大鼠急性經口毒性實驗 將受試大鼠按體重隨機分為4組,每組8只,雌雄各半。分別以發酵液1000、2150、4640、5000 mg/kg的劑量進行一次經口灌胃,灌胃體積為1 mL/100 g體重。灌胃前隔夜禁食,自由飲水。灌胃后立即觀察中毒表現,2 h后喂食。記錄中毒癥狀及死亡時間,持續觀察2周,用Horn氏法計算LD50值,按“急性經口毒性分級標準”評價結果。

急性經口毒性分級標準[19]:經口LD50(mg/kg):<5為劇毒,5～50為高毒,50～500為中毒,>500為低毒。若>5000,動物仍不死亡,不需要進行更高劑量的實驗。

1.2.8.2 家兔急性皮膚刺激實驗 選用無皮膚疾患的健康家兔4只,將軀干中部脊柱兩側皮毛剪短后用8%的Na2S溶液涂抹脫毛,脫毛面積為5×6 cm2,脫毛后24 h確認皮膚無損傷后,將0.5 mL菌劑滴于2×3 cm2大小的4層紗布上,貼敷于一側脫毛區,蓋1層玻璃紙后,用膠布和繃帶固定;另一側為對照,滴等量生理鹽水。兩側分別接觸4 h后,用溫水洗凈皮膚。按“皮膚刺激評分標準”評價結果。

皮膚刺激評分標準[19]:A 紅斑:無紅斑0分,紅斑勉強可見1分,紅斑明顯可見2分,重度紅斑3分,紫紅色紅斑到輕度焦痂形成4分;B 水腫:無水腫0分,水腫勉強可見1分,水腫明顯隆起2分,水腫皮膚處隆起1 mm,且輪廓清楚3分,水腫隆起1 mm以上并伴有擴大4分。總積分A+B,最高分值8分。

1.2.8.3 眼刺激實驗 選用健康家兔4只,分別取受試物0.1 g,撒入左眼結膜囊內,立即輕閉眼瞼約1 min,對照右眼加等量生理鹽水。觀察動物受藥后1、24、48、72、96、168 h后眼結膜、虹膜和角膜的刺激損傷和恢復情況。按照“眼損傷程度”評分[19]。眼損傷程度:

A結膜,觀察指標3項,充血狀態A1:血管正常充血0分,充血呈鮮紅色1分,充血呈深紅色血管不易分辨2分,彌漫性充血呈血紅色3分。水腫A2:無水腫0分,輕微水腫1分,明顯水腫,伴有部分眼瞼外翻2分,水腫至眼瞼近半閉合3分,水腫至眼瞼超過半閉合4分。分泌物A3:無分泌物0分,少量分泌物1分,分泌物使眼瞼和睫毛潮濕或粘著2分,分泌物使整個眼區潮濕和粘著3分。將動物A1、A2、A3分值相加即為結膜A的損傷情況。最高積分為10。

B虹膜,正常為0,皺折明顯加深,充血,腫脹,角膜周圍有輕度充血,瞳孔對光仍有反應1分,出血,肉眼可見破壞,對光無反應(或出現其中之一)2分。

C角膜(以最致密部位為準)角膜情況C1:無渾濁為0,彌漫性渾濁,虹膜清晰可見1分,半透明區易分辨,虹膜模糊不清2分,出現灰白色透明區,虹膜細節不清,瞳孔大小明顯看清3分,角膜不清楚,虹膜無法辨認4分。角膜受損范圍C2:角膜受損程度<1/4為1分,1/4～1/2為2分,1/2～3/4為3分,3/4～1為4分,角膜C受損程度為C1×C2。最高積分16。

眼刺激積分指數(I.A.O.I)=A×2+B×5+C×5,最高積分為110。

1.2.8.4 豚鼠皮膚變態反應(致敏)實驗 將20只豚鼠隨機分成兩組,實驗組和陽性對照組。實驗組給以生防菌,陽性對照組給以2,4-二硝基氯苯溶液。步驟如下:

A. 致敏接觸:實驗前24 h將動物背部左側去毛3×3 cm2。將0.2 mL的菌劑發酵液均勻涂于脫毛區,用2層紗布和1層玻璃紙覆蓋,再以無刺激膠布封閉固定,持續6 h后用溫水洗去受試物。第7 d和14 d以同樣方法重復一次。陽性對照組給以1% 2,4-二硝基氯苯溶液0.2 mL,操作同上。

B. 激發接觸:實驗前24 h將動物背部右側去毛2×2 cm2。末次致敏后14 d,將0.2 mL生防菌劑均勻涂于右側去毛區,操作方法同致敏接觸,持續6 h后用溫水洗去受試物,每日觀察皮膚情況至12 d。陽性對照組給以0.1%的2,4-二硝基氯苯溶液0.2 mL,操作方法同上。

將出現皮膚紅斑或者水腫(無論程度輕重)的動物數除以動物總數,求出動物致敏率[19]。

1.2.9 數據分析實驗數據 采用Origin 85和Excel 2007軟件進行處理分析。Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1生防菌不同發酵時間對草莓果實采后自然腐爛的影響

草莓于6 ℃下貯藏20 d后,結果見圖1 A。CK和經無菌水浸泡的果實腐爛指數無顯著性差異,其腐爛指數分別為87.96%和89.32%。生防菌經過不同時間的發酵后,與CK比,其腐爛指數有顯著性差異,其中發酵24 h的菌液效果最好,腐爛指數為40.15%,與CK比腐爛指數下降了54.35%。草莓于16 ℃下貯藏9 d后(見圖1 B),與6 ℃的結果相似,發酵24 h腐爛指數最低為51.43%,比CK下降了43.95%。該實驗結果與李靜[17]的體外實驗相一致,李靜發現該菌發酵24 h的平板抑菌圈直徑最大,其原因可能是發酵培養24 h時,該生防菌已完成了對數生長期,其活菌數達到最大值,其抑菌活性物質得到最大富集,從而且提高了抑菌活性最強,表現為果實腐爛率最低。

圖1 不同發酵時間對草莓自然腐爛的影響Fig.1 Effect on natural decay of strawberries with different fermentation times注：A:6 ℃ 20 d;B:16 ℃ 9 d。

圖2 不同處理方式對草莓自然腐爛的影響(16 ℃ 9 d)Fig.2 Effect on natural decay of strawberries with different process ways(16 ℃ 9 d)

2.2生防菌不同處理方式對草莓果實采后自然腐爛的影響

由圖2可知,采用噴淋和浸泡的方法均可以降低草莓果實的腐爛。噴淋的方式和浸泡30 s、1、2 min相比,無顯著差異,繼續增加浸泡時間,浸泡3 min中草莓的腐爛指數最低,為41.00%,與CK相比,其抑制達46.74%。再繼續增加浸泡時間為4 min時,草莓腐爛指數略有上升。其原因可能是浸泡時間較短或者噴淋時,菌株不能很好的附著在果實表面,隨著時間延長,附著菌液也會增多,能夠實現有效定殖,增強抑制能力,而當浸泡時間過長,由于草莓果皮較嬌嫩,缺乏保護層,果皮容易造成機械損傷,造成病害侵染,故腐爛指數增加。

2.3生防菌不同處理液對草莓采后自然腐爛的影響

草莓果實經生防菌不同處理液浸泡后,其自然腐爛情況見圖3。上清液、5倍稀釋上清液和10倍稀釋上清液的效果與CK相比無顯著差異,而發酵液和菌懸液及它們的5倍、10倍稀釋液與CK比有顯著差異,說明該生防菌的抑菌活性物質可能不在上清液中。其中,稀釋5倍的發酵液效果最好,果實腐爛指數為56.39%,與CK比,腐爛指數下降了37.56%。發酵液稀釋5倍后效果反而比發酵原液好,其原因可能是菌株的濃度太高,一些對果實不利的代謝產物分泌也較多,對果實造成一定傷害。

圖3 生防菌不同處理液對草莓自然腐爛的影響Fig.3 Effect on natural decay of strawberries with different treatment of B. contaminans注：CK:無菌水；A:發酵原液；B:稀釋5倍發酵液；C:稀釋10倍發酵液；D:菌懸液；E:稀釋5倍菌懸液；F:稀釋10倍菌懸液；G:上清液；H:稀釋5倍上清液；I:稀釋10倍上清液。

2.4生防菌不同處理液對草莓采后灰霉病的影響

生防菌不同處理液對草莓采后灰霉病的抑制效果見表1。從表1中可知,接種5 d后,CK發病達98.20%,病斑達到1.21 cm,發酵原液、稀釋5倍發酵液和菌懸液處理均未發病,稀釋10倍發酵液輕微發病,發病率為9.00%,而上清液和熱殺死液與CK發病率無顯著性差異,則抑菌效果好的主要是菌懸液和發酵液,這一結果與自然腐爛結果相似,進一步證明菌體胞外的上清液無抑菌活性,該菌株的主要抑菌物質為菌體細胞。

表1 生防菌不同處理液對草莓灰霉病的抑制Table 1 Inhibitory of different treatments of B. contaminans on Botrytis cinerea

2.5大鼠急性經口毒性實驗

經口給藥后,大鼠急性經口毒性實驗結果見表2。根據急性經口毒性標準,當LD50>5000 mg/kg即殺死一半實驗總體時的有毒物質的劑量>5000 mg/kg,可以不用在進行更高劑量的實驗,基本可認為該物質是低毒物質,從表2中可以看出,雌、雄性大鼠經口 LD50>5000 mg/kg,且在2周的觀察期內受試大鼠無死亡且無其他異常,因此,可認為該生防菌屬于低毒物質。

表2 大鼠急性經口毒性實驗結果Table 2 Result of acute oral toxicity test on rats

表3 家兔皮膚刺激實驗結果Table 3 Result of stimulation on the skin of rabbits

注:刺激強度分級:0～0.4無刺激性,0.5～1.9輕度刺激性,2.0～5.9中等刺激性,6.0～8.0強刺激性。

表4 眼刺激(不沖洗)實驗結果Table 4 Result of stimulation on the eyes(no wash)

注:I.A.O.I為0～5,M.I.O.I 48 h后為0為無刺激性;I.A.O.I為5～15,M.I.O.I 48 h后<5為輕度刺激性;I.A.O.I為15～30,M.I.O.I 96 h后小于5為輕度至中等刺激性;I.A.O.I為30～60,M.I.O.I 168 h后小于20為中度刺激性;I.A.O.I為60-80,M.I.O.I 168 h后小于40為中度至重度刺激性;I.A.O.I為80～110為重度刺激性。

2.6家兔皮膚刺激實驗

家兔皮膚刺激實驗結果見表3,根據皮膚刺激標準評分結果顯示,該生防菌沒有造成家兔皮膚產生紅斑及水腫,經皮膚刺激實驗72 h時,家兔皮膚刺激強度仍為無刺激性,因此可判斷該生防菌不會對皮膚產生刺激反應。則家兔皮膚刺激實驗結果為無刺激性。

2.7家兔眼刺激實驗

給藥后不洗眼,家兔眼刺激實驗結果如表4,從表中可看出,再受藥處理后的1、24、48、72、96、168 h時,該生防菌對眼結膜、虹膜和角膜刺激分數均為0,即眼刺激積分指數(I.A.O.I)為0,停止受藥后,觀察48 h后眼睛損傷恢復情況,眼刺激平均指數(M.I.O.I)48 h為0。實驗表明,家兔眼刺激實驗不沖洗實驗結果為無刺激性。

2.8豚鼠皮膚變態反應(致敏)實驗

表5為豚鼠皮膚致敏實驗結果。實驗期間,陽性對照(2,4-二硝基氯苯)組動物皮膚均出現不同程度的紅斑和水腫,皮膚粗糙等;實驗組動物皮膚均無紅腫,其致敏率為0%,致敏強度I級,屬弱致敏物。

表5 豚鼠皮膚致敏實驗結果Table 5 Results of dermal allergy reaction on guinea pigs

注:致敏率0～8,致敏強度為Ⅰ級,屬于弱致敏物;致敏率9～28,致敏強度為Ⅱ級,屬于輕度致敏物;致敏率29～64,致敏強度為Ⅲ,屬于中度致敏物;致敏率65～80,致敏強度為Ⅳ級,屬于強度致敏物;致敏率81～100,致敏強度Ⅴ級,屬于極強度致敏物。

3 結論

伯克氏菌可產生硝吡咯菌素、吩嗪、苯基吡咯、Cepaciamide A、Cepacidine A等多種次生代謝物質,在農業領域中具有生物防治、生物降解以及促進植物生長等多種功能,有廣泛應用前景[20-21]。目前已有伯克氏菌用于果實采后相關的報道,范青[22]發現伯克氏菌對甜櫻桃果實采后褐腐病表現顯著的抑制作用;該菌株可提高果實抗性相關酶POD、SOD、CAT、PPO、PAL等的活性[11]。本次實驗的研究表明,生防菌洋蔥伯克氏菌B.contaminans可以有效抑制草莓采后病害發生,且24 h發酵液的抑制效果最好。無論是自然腐爛,還是傷口接種,與CK比較均具有顯著性的抑制效果。在不同處理液中,菌懸液抑制效果顯著,上清液無抑菌性。這為我們研究抑菌機理,提取抑菌活性物質提供了基礎理論依據。

Vanlaere[23]認為洋蔥伯克霍爾德氏菌種內分為9個基因型,2008年Vanlaere[24]又分出Burkholderiaubonensis和另外5個新種,2009年Elke Vanlaere[25]又分出兩個新的基因型Burkholderiacontaminans和Burkholderialata,至此洋蔥伯克霍爾德氏菌復合群共包括17個其因型。文獻報道[26-27],對人體有致病性的基因型主要是基因型Ⅱ(B.multivorans)、基因型Ⅲ(B.cenocepacia)。本實驗中發現BurkholderiacontaminansB-1在動物急性經口毒性實驗,皮膚和眼刺激實驗及皮膚致敏性實驗中,沒有毒性,且對皮膚和眼睛沒有刺激性,對皮膚也沒有致敏性,說明該基因型菌株作為生防菌的人體安全性,具有進一步開發和應用價值。

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