紅樹林植物闊苞菊內生真菌硒富集工藝優化

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(1.欽州學院海洋學院,廣西北部灣海洋生物多樣性養護重點實驗室,廣西欽州 535000；2.欽州學院石油與化工學院,廣西高校北部灣石油天然氣資源有效利用重點實驗室,廣西欽州 535000)

硒是植物、動物包括人類必需的微量營養元素,是硒代半光谷氨酸(Sec)和含硒過氧化物酶,如谷胱甘肽過氧化物酶GPx等的重要成分,具有提高人體免疫力、抗氧化、抗腫瘤、拮抗重金屬、延緩衰老、保護心肌和肝臟健康和提高生殖機能等多種功效[1]。缺硒是導致大骨節病、克山病、糖尿病等一系列疾病的重要原因[2-3]。因此,科學補硒已成為當前人們防止疾病、增進健康和延緩衰老的重要舉措之一[4-5]。研究表明,有機硒不僅毒性低,與無機硒相比,攝入有機硒對提高實驗大鼠組織中GSH-Px(肝臟:有機硒組/無機硒組:265.13±8.62/250.39±6.32 U/mg pro)、SOD(心臟:有機硒組/無機硒組:96.16±1.42/93.30±4.01 U/mg pro)、GSH(腎臟:有機硒組/無機硒組:34.65±1.06/30.18±1.44 U/mg pro)活力水平更為顯著[6]。由于微生物具有繁殖快、適應力強、代謝產物豐富等優勢。因此,微生物轉化無機硒獲得安全有效的有機硒源,成為了開展研究的焦點[7-9]。

海洋是世界上公認的最大的微生物生存的寶庫,利用微生物發酵生產活性有機硒物質,不但周期短,而且可實現大規模培養,也是豐富有機硒的來源的有效途徑[10-11]。但是,同時也面臨著菌體硒的耐受能力差異大、有機硒的轉化率低等一些問題。因此,對富硒地區的微生物的硒富集能力進行篩選、馴化以及發酵工藝優化,才能有望獲得富硒能力強的菌株。

本文采用單因素實驗、正交實驗法對廣西北部灣富硒地區[12]半生紅樹林植物闊苞菊內生真菌的硒耐受能力、生長條件及硒富集能力進行了初步的研究,旨在探索闊苞菊內生真菌富集硒的最優化條件,篩選馴化富硒菌種。并為進一步開發海洋植物內生富硒真菌以及其有機硒的代謝產物在食品、醫藥應用等方面的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

本研究菌種為實驗室保藏的一株自闊苞菊葉片中純化分離得到綠色真菌,闊苞菊采樣地點為廣西欽州市茅尾海;硒粉(分析純) 天津市光復精細化工研究所；高氯酸(質量分數為70%,優級純) 天津市鑫源化工有限公司;濃硝酸(質量分數為65%,優級純) 國藥集團化學試劑有限公司;碘化鉀 天津大茂化學試劑廠;阿拉伯樹膠 山東西亞化學股份有限公司;葡萄糖(分析純)、乳糖(分析純)、蔗糖(分析純) 天津市福晨化學試劑廠;麥芽糖(分析純) 上海埃彼化學試劑有限公司;馬鈴薯 市售。

UV.2802H型紫外可見分光光度計 上海優浦科學儀器有限公司(進口);FA1104N型電子分析天平 上海明橋精密科學儀器有限公司;ZHWY-211B型恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;LHR-250-H型恒溫培養箱 韶關市泰宏醫療器械有限公司;LDZX-75KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申醫療機械廠;HS-G-2A型雙人超凈工作臺 無錫云潔凈化設備有限公司等。

1.2實驗方法

1.2.1 培養基與培養方法

1.2.1.1 培養基硒溶液的制備 稱取0.10 g硒粉,按照1.2.2.2的方法對硒粉進行消解處理,并用NaOH溶液調至pH為7,然后定容至1000 mL,此溶液作為硒儲備液(100 μg/mL);取400 mL硒儲備液定容至1000 mL,配成濃度為40 μg/mL的硒溶液,備用。

1.2.1.2 培養基的制備 菌種活化培養基:去皮馬鈴薯200 g/L、葡萄糖15 g/L、海鹽5 g/L、瓊脂15 g/L,分裝規格為100 mL/瓶,于121 ℃條件下滅菌30 min,備用;種子培養基:去皮馬鈴薯200 g/L、葡萄糖15 g/L、海鹽5 g/L,分裝規格為100 mL/瓶,于12l ℃條件下滅菌30 min,備用。

富硒培養基:去皮馬鈴薯200 g/L,按照單因素、正交實驗要求加入碳源(葡萄糖、乳糖、麥芽糖及蔗糖);碳源濃度為10～30 g/L,海鹽濃度為0～7 g/L;培養基中不同的硒含量通過添加不同體積的1.2.1.1方法中制得的硒溶液實現,每100 mL培養基添加范圍為10～50 mL,其中,硒溶液濃度為40 μg/mL。其中,以精制海鹽配比培養基的鹽濃度,模擬潮間生長環境[13]。

1.2.1.3 培養方法 菌種的活化:在無菌條件下,將菌種接種到斜面培養基(菌種活化培養基)后,置于26 ℃培養箱中恒溫培養72 h,菌種長滿平板時待用;液體種子的制備:在長滿菌種的斜面培養基中加入5～8 mL無菌水,刮取菌絲,采用膠頭滴管吸取適量的混合液體(菌絲+無菌水)于種子培養基中,30 ℃、150 r/min搖床培養48 h,菌絲體長滿搖瓶后待用[14];富硒培養:往長滿菌體的搖瓶中分別加入不同體積(10、20、30、40、50 mL)的1.2.1.1中硒溶液,以達到控制硒濃度的目的,培養條件為26 ℃,150 r/min搖床中培養12、24、36、48、60 h。

1.2.2 硒含量測定方法

1.2.2.1 菌絲體生物量的測定 菌絲體收集:硒元素富集時間結束后,用濾紙過濾菌絲,并用蒸餾水洗滌3～5次,刮取菌絲體于烘干至恒重的培養皿中,60 ℃下烘干至恒重,稱量其質量即可得生物量,以g/L表示。

1.2.2.2 樣品消解 樣品消解方法參照GB5009.93-2010,具體方法為:稱取0.1 g經干燥粉碎的均勻試樣于25 mL的比色管中,加入消解液5 mL(濃硝酸與高氯酸混合比例為4∶1)后蓋上玻璃塞并進行24 h冷消化處理。水浴加熱消化處理,加熱期間可定時振蕩比色管以促進樣品粉末的完全溶解[15-16]。待樣品溶液呈現透亮、清澈狀態時,則表明樣品消化完畢,樣品消解過程耗時大致為3～5 h。于澄清溶液中加入5 mL 6 mol/L鹽酸,沸水浴環境中進行30 min驅趕硝酸操作,消解液冷卻,備用。

1.2.2.3 硒含量的計算方法 硒標準曲線的測定:硒標準溶液準確稱取0.10 g硒粉,按照1.2.2.2的方法對硒粉進行消解處理后,定容至1000 mL,取400 mL硒儲備液定容至1000 mL,配成濃度為40 μg/mL的硒標準溶液,備用。于25 mL比色管中,分別吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL硒標準溶液,加入1.0 mL 1 mol/L HCl溶液、1.0 mL 2 g/L KI溶液、1.5 mL 2 mol/L NaF溶液、1.5 mL 10.0 g/L阿拉伯樹膠溶液,用二次蒸餾水定容混勻,以試劑空白為參比,于352 nm波長下測定溶液的吸光值,并繪制標準工作曲線[17-18]。

樣品的測定:將1.2.2.2樣品消解液,于25 mL比色管中加入1.0 mL 1 mol/L HCl溶液、1.0 mL 2 g/L KI溶液、1.5 mL 2 mol/L NaF溶液、1.5 mL 10.0 g/L阿拉伯樹膠溶液,定容混勻,以試劑空白為參比,于352 nm波長下測定溶液的吸光值。

式中,Cx-于校準曲線查得的硒含量,單位為μg/mL;V-樣品消解液的定容體積,單位為mL;m-測量的樣品質量,單位為g;X-單位硒含量,單位為μg/g干菌體。

富硒總量計算方法:富硒總量(μg/L)=生物量(g/L)×單位硒含量(μg/g干菌體)。

有機硒轉化率計算方法:轉化率(%)=(富硒總量/硒元素添加總量)×100。其中,硒元素添加總量(μg)=硒溶液添加量(mL)×40 μg/mL(1.2.1.1中硒溶液濃度)。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 硒標準溶液添加量的確定 固定碳源為葡萄糖、碳源濃度20 g/L、鹽濃度5 g/L、培養時間36 h,考察不同的硒標準溶液添加量(10、20、30、40、50 mL)對菌體硒富集能力的影響。

1.2.3.2 鹽濃度的確定 固定碳源為葡萄糖、碳源濃度20 g/L、培養時間36 h、硒標準溶液添加量30 mL,考察不同的鹽濃度(0、1.5、3、5、7 g/L)對菌體硒富集能力的影響。

1.2.3.3 碳源濃度的確定 固定碳源為葡萄糖、鹽濃度5 g/L、培養時間36 h、硒標準溶液添加量30 mL,考察不同的碳源濃度(10、15、20、25、30 g/L)對菌體硒富集能力的影響。

1.2.3.4 培養時間的確定 固定碳源為葡萄糖、碳源濃度20 g/L、鹽濃度5 g/L、硒標準溶液添加量30 mL,考察不同的培養時間(12、24、36、48、60 h)對菌體硒富集能力的影響。

1.2.3.5 碳源種類的確定 固定碳源濃度20 g/L、鹽濃度5 g/L、培養時間36 h、硒標準溶液添加量30 mL,考察不同的碳源(葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖)對菌體硒富集能力的影響。

1.2.4 正交實驗 根據單因素實驗結果,選擇對菌種富硒能力影響較大的硒標準液添加量、培養時間、碳源濃度和鹽濃度四個因素進行L9(34)正交實驗,因素水平表如表1所示。以每組菌絲體的富硒總量(μg/L)為指標,確定最佳培養條件。

表1 正交實驗的因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 數據統計分析 所有實驗數據應用Excel 2010軟件進行數據的分析及作圖。

2 結果與分析

2.1硒標準曲線的繪制

以試劑空白為參比,于352 nm波長下測定各梯度標準濃度溶液的吸光值,并繪制標準工作曲線。測得其溶液吸光度A與溶液硒濃度間線性關系良好,標準曲線為:A=0.6939 Cx+0.0094,R2=0.9967。

圖1 標準曲線Fig.1 Standard Curve

圖2 吸收曲線Fig.2 Absorption Curve

2.2單因素實驗

2.2.1 硒溶液添加量對菌株富集硒的影響 由圖3可知,硒溶液添加量對富集硒元素的能力存在較大影響。隨著培養基內硒濃度的增大,菌絲體的單位硒含量由43.9 μg/g增加至179.8 μg/g、富硒總量最大值為1923.8 μg/L;當硒液添加量為30 mL時,有機硒的轉化率為16.18%。然而,隨著硒溶液添加量的依次增加,菌絲體的生物量由7.7 g/L增至10.7 g/L,然后降至8.9 g/L,總體變化趨勢為先升高后降低。因為菌絲體對硒有一定的耐受限度濃度,低濃度的硒濃度能促進菌絲體生長,進而提高菌株富集硒元素的能力;由于硒元素的毒性,高濃度的硒濃度抑制菌絲體的生長,使富集硒元素的能力下降。

圖3 不同硒溶液添加量對菌株富集硒的影響Fig.3 Effect of different selenium concentration on the enrichment of selenium

2.2.2 鹽濃度對菌株富集硒的影響 由圖4可知,以添加NaCl調節培養基的鹽濃度,模擬潮間帶生長的環境對菌體的富集硒的能力有促進效果。在培養基鹽濃度0～5 g/L時,菌株的生物量由8.7增至10.7 g/L、單位硒含量由16.9 μg/g增加至180. 6 μg/g,增大10倍;而富硒總量最大值為1932.4 μg/L,比不增加NaCl時增大了13倍。在鹽濃度為5 g/L條件下,有機硒的轉化率為16.21%。培養基中的鹽濃度在0～5 g/L范圍內能促進菌絲體生長,一般認為Cl-的濃度直接影響菌體的酶活力[19],從而提升菌株富集硒元素的能力。

圖4 不同鹽濃度對菌株富集硒的影響Fig.4 Effect of different concentrations of salt on selenium enrichment

2.2.3 碳源濃度對菌株富集硒的影響 以葡萄糖作為碳源,探討了不同的碳源濃度對菌株富硒總量的影響,結果如圖5所示。在10～30 g/L的碳源濃度范圍內增加碳源濃度,菌絲體的生物量曲線趨于平穩,生物量平均值約為10.6 g/L;然而碳源濃度的增大,對菌株的富硒能力有明顯的抑制,富硒總量由最高值1792.1 μg/L降至446.5 μg/L,即15 g/L的碳源濃度最適于菌體產生有機硒代謝產物,有機硒的轉化率僅為14.93%,低于或高于此濃度轉化率逐漸降低,其代謝機制尚未明確。這在真菌發酵代謝其他活性物質,如黃酮等有類似的實驗結果[20]。

圖5 不同碳源濃度對菌株富集硒的影響Fig.5 Effect of different carbon source concentrations on the enrichment of selenium

2.2.4 培養時間對菌株富集硒的影響 培養時間為24 h時,最適于菌絲體內有機硒產物的積累,富硒總量達到最高值1940.9 μg/L,單位硒含量增加了1.9倍;超過24 h后,菌絲體的生物量緩慢降低,即菌株的生長受到抑制,甚至出現了菌絲自溶現象。推斷可能的原因是培養基內的營養物質被消耗殆盡,無法為菌株的生長、富集硒提供必需的條件。因此,選擇12、24、36 h的3個因素水平進行正交實驗。

圖6 不同培養時間對菌株富集硒的影響Fig.6 Effect of different incubation time on the enrichment of selenium

2.2.5 碳源種類對菌株富集硒的影響 葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖四種碳源條件下,所得的菌絲體生物量分別為10.3、10.8、10.8、9.8 g/L,生長曲線趨于平穩,以葡萄糖、乳糖作為培養碳源時,有機硒的轉化率約為14.0%,富硒總量分別為1634.4 μg/L和1740.1 μg/L,明顯優于麥芽糖、蔗糖,當使用蔗糖作為碳源時,富硒總量僅為609.9 μg/L。由此可見,不同的碳源直接影響菌株的硒富集能力。蔗糖屬于大分子物質非還原性糖類,不具有游離的醛基與酮基,不利于菌體直接吸收利用,因而引起硒富集低[21-22]。

圖7 不同碳源種類對菌株富集硒的影響Fig.7 Effect of different carbon sources on the enrichment of selenium in strains

2.3正交實驗

實驗結果見表2,4種因素主次順序為D>A>B>C,表明培養基的鹽濃度、硒含量是菌株的富集硒主要影響因素,富硒培養基最佳的組合水平為A2B2C2D2,即鹽濃度5 g/L,硒溶液添加量30 mL,培養時間24 h,碳源(葡萄糖)濃度15 g/L。在最優化水平驗證實驗結果,富硒總量為1941.7 μg/L,菌絲體生物量為10.7 g/L,有機硒轉化率為16.2%。

表2 正交實驗結果Table 2 Results of orthogonal test

3 結論

在自然條件下,特別是在缺硒地區,適量的補硒可以防治動物因體內硒含量過低而引發疾病[2-3]。因此,獲得安全有效的硒源是關鍵。本文采用單因素實驗、正交實驗法對紅樹林植物闊苞菊內生真菌的硒富集能力及培養條件進行研究,確定了最適于的發酵條件為:硒溶液添加量為30 mL,鹽濃度5 g/L,碳源(葡萄糖)濃度15 g/L,培養時間24 h。發酵得到菌絲體富硒總量為1941.7 μg/L,有機硒轉化率僅為16.2%,實驗中發現菌絲體在加入硒溶液后培養初期出現了自溶現象,以致結果與文獻值[22]相比偏低。海洋是地球上最大的微生物生存的寶庫,因此進一步篩選有機硒轉化能力強的海洋紅樹林植物內生菌種,對開發利用海洋真菌,同時豐富有機硒來源途徑,具有較大的科研意義。

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