一株塔賓曲霉的分離鑒定及其在地溝油鑒別中的應用

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(1.西南林業大學,西南地區生物多樣性保育國家林業局重點實驗室,云南昆明 650224;2.云南省林業科學院,國家林業局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室,云南省森林植物培育與開發利用重點實驗室,云南昆明 650201)

地溝油是過氧化值、酸價、水分、羰基價、丙二醛、AFB1等指標嚴重超標的非食用油,質量、衛生情況極差,一般分為3類[1]:一是狹義的地溝油,即將下水道中的油膩漂浮物或者將賓館、酒樓的剩飯、剩菜(通稱潲水)經過簡單加工、提煉出的油;二是劣質豬肉、豬內臟、豬皮加工以及提煉后產出的油;三是用于油炸食品的油使用次數超過規定要求后,再被重復使用或往其中添加一些新油后重新使用的油[2]。近年來,隨著我國餐飲業規模日益擴大,餐飲廢水中排除的廢棄油脂日益增多,每年大約200～300萬噸地溝油返回餐桌[3]。據實驗測定,長期攝入地溝油會對人體造成嚴重傷害,其結果會導致發育障礙,腸炎,肝、心、腎腫大,以及脂肪肝等[4]。因此,鑒別地溝油的檢驗方法的研究對地溝油的治理意義重大。

由于地溝油和食用油在制作工藝和成分上十分相似,傳統的物理和化學檢測不能有效鑒別出地溝油和普通食用油。于是一些不法商販因地溝油價格低廉,來源廣泛,化學結構復雜等特點[5],將地溝油經過簡單處理后直接賣給了酒店和食堂充當食用油,嚴重威脅著人類的健康。截至目前,我國每年破獲的地溝油案例屢見不鮮,并且一些政府部門也全力組織科研攻關,研究了眾多鑒別 “地溝油”的方法[6-8]。其中較為常見的方法包括:感官法、色差法、電導率法、折光率法、基因成分分析法等。但利用微生物的特異性來鑒別地溝油和食用油的研究尚未見報道。

與普通食用油相比,地溝油中滋生著大量的微生物,其中還含有一些特殊的物質,一些微生物對地溝油中的微小差異是十分敏感的,并且大部分微生物會隨著環境的改變,在一定的限度內,其形態、生理、生化、生長繁殖等特征甚至微生物群落都有可能發生改變[9]。因此,利用地溝油中特殊的物質或者生境來分離培養特異菌株,并應用于地溝油的鑒別研究之中,對于地溝油的鑒別檢測技術的發展意義重大。本實驗以地溝油中的真菌微生物為主要來源,篩選出能高效利用地溝油的特異菌株DGY03,并將其接種于以地溝油和標準食用油為唯一營養源的培養基中,比較了其在地溝油和食用油培養基上的生長速度、菌落形態以及培養基顏色變化等特征。確定了DGY03作為指示菌鑒別地溝油的可行性,為后期微生物作為指示菌鑒別地溝油打下堅實的基礎。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

地溝油 潲水油,由某火鍋店提供;大豆油、菜籽油、玉米油、花生油為標準食用油 由某大型超市提供;瓊脂、培養皿、試管、聚乙烯醇等 昆明豐科生物科技有限公司;牛肉膏、氫氧化鈉、磷酸、活性白土 昆明愛卓商貿有限公司;真菌DNA快速提取試劑盒(溶液型)、2×Taq PCR MasterMix、ITS通用引物(ITS1-ITS4)等均由上海生物工程技術服務有限公司提供。

DF-3恒溫磁力攪拌器 蘇州威爾實驗用品有限公司;2XZ直聯型旋片式真空泵 浙江揚子江泵業有限公司;UV-2450紫外分光光度計 津島有限公司;DM750顯微鏡 北京中儀光科科技發展有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫療設備廠;HH-2數顯電子恒溫水浴鍋 丹瑞電器廠;HC-2518R高速冷凍離心機 安徽中科中佳儀器有限公司;SW-CJ-1D潔凈工作臺 江蘇蘇潔凈化設備廠;HH.B11-BS電熱恒溫培養箱 上海躍進醫療器械有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 培養基的配制 富集培養基:蛋白胨10.0 g/L,馬鈴薯粉5.0 g/L,葡萄糖15.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,氯霉素0.025 g/L。

真菌分離培養基:馬鈴薯200.0 g,葡萄糖20.0 g,瓊脂20.0 g,放入三角瓶中,加蒸餾水至1000 mL,121 ℃滅菌20 min。

平板篩選培養基:(NH4)SO41.0 g,K2HPO41.0 g,KCl 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,精煉地溝油10 mL,瓊脂20.0 g,加蒸餾水至1000 mL,pH7.0～pH7.5,121 ℃滅菌20 min。

復篩培養基:精煉地溝油10 mL,瓊脂20.0 g,pH7.0～pH7.2,加蒸餾水至1000 mL,121 ℃滅菌20 min。

應用培養基:精煉地溝油、大豆油、菜籽油、玉米油、花生油各10 mL,分別加入瓊脂20.0 g,pH7.0～pH7.2,加蒸餾水至1000 mL,121 ℃滅菌20 min。配成五種以不同樣品油為唯一營養源的培養基。其中實驗所需的精煉地溝油均為除臭后的地溝油,且在配制各種培養基時,需預先將樣品油與聚乙烯醇(體積分數為20%)以1∶3的比例混合,攪動乳化5 min,即配制成乳化液。滅菌后,再將其加入到培養基中。

1.2.2 地溝油的精煉

1.2.2.1 地溝油的精煉工藝 地溝油的精煉工藝主要包括脫膠、脫酸、脫色以及脫臭等流程。其最佳工藝參數參照餐飲業潲水油精煉工藝的方法[10]。即首先向地溝油中加入0.10%(v:v)磷酸,在55 ℃水浴35 min后,加2%的去離子水(v:v)進行脫膠;其次加入0.33%的超堿(氫氧化鈉占粗油重的百分數)使其堿液濃度為17.58°Be,75 ℃進行堿練;然后加入4.0%(w∶w)的活性白土,按攪拌速度為50 r/min,在65 ℃水浴中攪拌35 min進行脫色;最后在殘壓為0.53 Pa,脫臭溫度為256 ℃,于直聯型旋片式真空泵中脫臭5.6 h形成精煉地溝油。

1.2.2.2 地溝油的理化指標檢測 地溝油的理化指標檢測參照國家食用油衛生標準GB2716-2005對油脂的各種理化指標作出的規范和限定,本實驗主要對精煉地溝油的酸價(AV)、過氧化值(POV)、羥基價、以及碘價(I.V)進行了測定,其測定方法均參照餐飲業潲水油脂的理化檢測方法[10]。

1.2.3 實驗樣品的預處理和真菌的分離純化 由于實驗所用的地溝油樣品含有部分顆粒狀雜質,需對地溝油樣品進行預處理,其處理方法參照地溝油與食用油中微生物群落結構多樣性比較[9]的方法。然后取樣品油10 mL,加入30 mL滅菌的聚乙烯醇(體積分數為20%)在35 ℃水浴中振蕩混合5 min,最后倒入100 mL滅菌的富集培養基中,制成懸液。置于28 ℃,150 r/min的搖床上振蕩培養2 d。將富集液用無菌水進行梯度稀釋,取稀釋濃度為10-3的稀釋液,涂布于分離培養基中,置于28 ℃培養箱中培養4 d,挑選出在培養基上生長良好的菌株。并進行純化培養,挑取單菌落接種到試管斜面中,在4 ℃保存備用。

1.2.4 真菌的篩選 經分離純化培養后,分別將純化后的菌株接種于平板篩選培養基中,置于28 ℃培養箱中培養4 d,挑選出生長良好的菌株。并將其接種于復篩培養基中,置于28 ℃培養箱中培養7 d,觀察其生長狀況以及培養基顏色變化等特征,最終將能在地溝油中大量生長繁殖或者培養基有明顯變色現象的菌株作為特異菌株,并進一步將其作為指示菌應用于地溝油的鑒別研究之中。

1.2.5 特異菌株的鑒定

1.2.5.1 特異菌株DNA提取和ITS PCR擴增 特異菌株DNA的提取采用真菌DNA快速提取試劑盒(溶液型)。在提取菌株DNA后,進行ITS擴增[11]。正向引物:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和反向引物:5′-TCCT CCGCTTATTGATATGC-3′。PCR采用50 μL反應體系:2×Taq PCR MasterMix 25 μL,primerF(10 μmol/L)2.0 μL,primerR(10μmol/L)2.0 μL,DNA template 1.0 μL,補足ddH2O至50 μL。PCR擴增條件:94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30個循環;72 ℃ 10 min;4 ℃ 30 min。用質量分數為0.8% 瓊脂糖凝膠進行PCR 產物的檢測,20 min后,用凝膠成像儀照相檢測。

1.2.5.2 特異菌株ITS序列分析 將擴增的 PCR 產物送昆明擎科有限公司純化并測序。并將測序所得序列在NCBI數據庫(http://blast.st-va.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)中進行BLAST序列相似性比對,從中獲取與該菌株序列同源性較高的部分菌株序列,用ClustalX按照最大同源性的原則進行排序,并用BioEdit 5.0.9進行序列對齊,最后用MEGA 6.0軟件進行系統發育樹構建,以確定其種屬地位。

1.2.6 特異菌株的應用 為了將篩選出的特異菌株應用于地溝油的鑒別之中,本實驗以地溝油和四種標準食用油(分別為大豆油、菜籽油、玉米油、花生油)作為唯一營養源配制成應用培養基,從培養好的特異菌株的菌落邊緣,用直徑為5 mm的打孔器取菌餅,將菌餅用接種針接入到培養基的中心位置,菌絲面向下,每種培養基重復3次,同時以加有10 mL的無菌水作為空白對照。放入28 ℃恒溫培養箱,培養7 d,觀察并比較菌株在不同類型培養基上的菌落生長速度、菌落長勢以及培養基顏色變化等特征。其中菌落直徑的測定采用十字交叉法,菌落生長速度=(菌落平均直徑-菌餅直徑)/菌株培養天數。

2 結果與分析

2.1地溝油的精煉結果

依據中華人民共和國食用油衛生標準GB2716-2005對油脂的各種理化指標作出的規范和限定,本實驗主要對經精煉后地溝油(圖1)的酸價、過氧化值、羥基價、以及碘價進行了測定,其結果見表1。

圖1 地溝油精煉過程中各油樣外觀對比Fig.1 The comparison of respective sample oil in the oil refining process of gutter oil注:A：脫膠油；B：脫酸油；C：脫色油；D：除臭油。

檢測項目植物油衛生標準(參照GB2716-2005)精煉地溝油是否超標AV(mg/g)≤3028否POV(g/100g)≤025019否羥基價(meq/kg)≤500423否IV(g/100g)約10085否

由結果可知,地溝油經精煉后其酸價、羥基價、過氧化值以及碘價的指標已達到植物油衛生標準。但與市售食用植物油相比,精煉地溝油在羥基價、過氧化值、油脂色澤等方面仍存在較小的差距。

2.2菌株分離結果

經分離純化培養,從地溝油中分離出8株生長較好且形態各異的真菌菌株,分別編號為DGY01～DGY08。

2.3特異菌株的篩選結果

經平板篩選培養后,初步獲得了2株生長良好的菌株,分別將其命名為DGY03和DGY05,其菌落形態特征及菌絲或孢子等顯微結構特征如圖2。由圖2可知,菌株DGY03菌落平坦,呈同心圓狀,邊緣具有白色的菌絲體,質地絲絨狀;分生孢子球形或近球形,壁近于平滑至稍粗糙;分生孢子梗發生于基質,老時黃色或黃褐色,壁平滑,頂囊球形或近球形。菌株DGY05菌落致密,菌絲有橫隔,分生孢子梗亦有橫隔,光滑或粗糙;分生孢子球形、橢圓形或短柱形,光滑或粗糙,大部分生長時呈藍綠色;分生孢子梗經過多次分枝,產生幾輪對稱或不對稱的小梗,形如掃帚,稱為帚狀體。

圖2 菌株DGY03和DGY05在平板篩選培養基上的菌落形態和顯微結構特征Fig.2 The colony morphology and microstructure characteristics of the strain DGY03 and DGY05 in filter medium注:A、B表示DGY03；C、D表示DGY05。

通過將獲得的DGY03和DGY05分別接種于復篩培養基中,觀察其在地溝油培養基上的生長狀況以及菌落形態等特征。其結果發現,菌株DGY03在培養基中表現出較強的生長繁殖現象(圖3)。即當恒溫培養7 d,其菌落擴散直徑為40～55 mm,但與圖2相比,菌落表面不再呈同心圓狀,而是呈粉末狀,且邊緣無明顯的白色菌絲體。而菌株DGY05在培養基上則表現出生長緩慢、菌絲體不發達、無明顯產孢現象等特點,不能有效地以地溝油為營養源進行生長繁殖。綜上所述,本實驗將能在地溝油培養基上快速生長繁殖的菌株DGY03作為特異菌株。

圖3 菌株DGY03在地溝油培養基上的生長狀況和菌落形態Fig.3 The growth and colony morphology of the strain DGY03 in the gutter oil medium

2.4特異菌株的鑒定結果

2.4.1 菌株DGY03的PCR擴增結果 用通用引物對菌株DGY03的ITS序列進行PCR擴增,得到重復性好、穩定清晰的特異擴增片斷,長約650 bp(圖4)。

圖5 基于ITS序列構建的菌株DGY03系統發育樹Fig.5 The phylogenetic dendrogram of the strain DGY03 based ITS sequences

圖4 菌株DGY03 rDNA ITS區段PCR產物電泳結果Fig.4 The PCR results of the strain DGY03 in rDNA ITS segment注:圖譜中1、2代表DGY03,M代表標準DL2000。

2.4.2 菌株DGY03的ITS序列測定及系統進化分析 通過對菌株DGY03的ITS序列進行PCR擴增,獲得了大約650 bp的拼接序列(Genbank登錄號:MF186869)。將DGY03在NCBI中BLAST同源性比對后,構建確定其分類地位的系統發育樹(圖5),由圖5可知DGY03與塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)的同源性達100%,由此可將DGY03歸為塔賓曲霉,屬子囊菌門,散囊菌綱,散囊菌目,曲霉科,曲霉屬。

2.5菌株DGY03的應用結果分析

本實驗通過分別比較菌株DGY03在地溝油和四種不同類型食用油培養基上的菌落生長速度、菌落長勢、菌落形態以及培養基顏色變化等特征(表2,圖6),研究其作為指示菌鑒別地溝油的可行性。

表2 菌株DGY03在不同樣品油培養基上生長變化情況的比較Table 2 The comparison of growth and variation of the strain DGY03 in the different sample oil culture medium

圖6 菌株DGY03在地溝油培和花生油培養基上的生長狀況和菌落形態的比較Fig.6 The comparison of growth and colony morphology of strain DGY03 in gutter oil and peanut oil注:A地溝油培養基 B 花生油培養基。

由表2和圖6可知,菌株DGY03在地溝油和食用油培養基上的菌落表面形態和培養基顏色變化方面基本一致,無明顯差異現象。但菌株DGY03在地溝油培養基上的菌落生長速度和菌落長勢明顯優于其它四種食用油培養基,且菌株DGY03在四種食用油培養基上菌落生長速度和菌落長勢基本一致。其在大豆油、菜籽油、玉米油、花生油培養基上的菌落生長速度分別為0.21、0.28、0.24、0.29 cm/d,而在地溝油培養基上的菌落生長速度為0.64 cm/d,對照組則無明顯生長現象。由此說明由于地溝油成分復雜,其內所含的某些特殊成分能夠為其生長繁殖提供部分營養物質,從而使菌株DGY03在地溝油培養基上更好的生長繁殖。

因此綜上所述,通過比較菌株DGY03在地溝油和食用油培養基上的菌落生長速度以及菌落長勢等變化特征,能夠有效地區別出地溝油與食用油間的差別。由此初步推斷,可以利用微生物對地溝油的特異性來鑒別地溝油。

3 結論

本研究對從地溝油中分離得到的8株真菌進行了特異性研究,經篩選分離培養出了一株能在只含有精煉地溝油的培養基上大量生長繁殖的特異菌株DGY03,并通過該菌株的菌落形態、微觀結構以及rDNA ITS序列分析相結合,判斷該特異菌株為塔賓曲霉(Aspergillustubingensis)。同時根據該菌株在地溝油和食用油培養基上生長變化情況等特征的比較,初步探討了其在地溝油鑒別領域的應用價值。由實驗結果可知,菌株DGY03在地溝油培養基上無論從菌落生長速度還是菌落長勢方面比較都明顯優于大豆油、菜籽油等四種食用油,這說明了由于地溝油來源廣泛,其中含有部分供微生物生長所需的微量元素和營養物質,經精煉后的地溝油也無法完全去除。故經精煉后的地溝油不僅能為菌株DGY03提供豐富的碳源,而且還能提供部分供其生長所需的特殊營養物質。同時由于實驗所需的大豆油、菜籽油、玉米油以及花生油都是市場上購買的未經使用過的標準食用油,其內所含營養物質相較于地溝油更為單一,部分可能缺乏供其生長所需的必要物質,大大限制了該菌株在其培養基上生長繁殖,故表現出菌絲體不發達,生長速度較慢等特征。由此可見,利用地溝油所含物質的特殊性或者豐富性來篩選分離菌株,并根據其在不同樣品油培養基上的菌落生長速度以及菌落長勢等差異可應用于地溝油的鑒別之中。

由于運用微生物作為指示菌鑒別地溝油,首先得收集大量的不同來源的地溝油,大量篩選菌株,篩選出能對多種不同來源地溝油敏感的菌株,并且還要與市場上各種標準食用油進行對比分析,從而才能最終確定敏感指示菌株;其次菌株長時間的保藏,在應用方面菌株可能存在退化的可能,這還需不斷對指示菌進行復壯才能達到檢測效果;然后由于地溝油精煉技術不斷改進和提高,精煉后的地溝油在理化性質方面已經接近食用油的標準,這對于指示菌的敏感性將進一步增加其難度;最后運用指示菌鑒別地溝油需要研究標準檢測方法和操作流程,這需要做大量的研究工作。本實驗只針對從地溝油中分離到的部分真菌進行簡單的篩選和觀察,目的在于運用微生物學方法研究鑒別地溝油的可行性,這離實際應用仍然存在一定差距,后期還需要選取不同來源的地溝油,對其培養條件進行優化,確定菌株DGY03是否為地溝油所特有的菌株,從而將其作為鑒定地溝油的標準。截至目前,科學家們并沒有找到一種較可靠的方法來檢測和鑒別地溝油[12],但隨著目前指示菌的深入研究[13-14]以及微生物學和基因工程的快速發展,相信在不久的將來從微生物角度出發有望為地溝油鑒別領域開辟一條新的思路。

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