芒果皮渣多糖脫蛋白和脫色工藝研究

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(1.中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，農業部熱帶果樹生物學重點實驗室,廣東湛江 524091;2.中國熱帶農業科學院農產品加工研究所,廣東湛江 524001)

芒果,又名蜜望、檬果,是漆樹科常綠喬木,含有豐富的糖類、蛋白質、維生素、類胡蘿卜素和鈣質等營養成分[1],素有“熱帶水果之王”之稱[2-4]。多糖是芒果皮渣的主要活性成分之一,研究表明,芒果多糖具有抗氧化[5-7]、抗癌[8]、抗肝毒[9]、抗菌[10]等作用。游離蛋白質和色素是芒果皮渣多糖提取過程中的主要雜質,不但影響多糖的純度和生物活性,而且對其分離純化及結構表征研究帶來很大困難[11]。因此,尋求一種除蛋白效果好、脫色率高、對多糖損失少的脫蛋白和脫色工藝尤為重要。目前,植物多糖常用的脫蛋白方法有Sevage法、三氯乙酸(TCA)法、酶法、鹽酸法和鞣酸法等,由于單獨使用一種方法蛋白質脫除率較低,因而也有將幾種方法聯用來進行脫蛋白[12]。脫色方法主要有活性炭法[13]、殼聚糖法、H2O2法[14]、聚酰胺法、大孔吸附樹脂法[15]等,活性炭由于吸附能力強,脫色成本低且不易影響提取物的生物活性而在工業化生產中得到了廣泛應用。基于此,本研究以實驗室自制的芒果皮渣多糖為原料,采用9種方法對其進行脫蛋白處理,選擇活性炭對TCA-正丁醇法脫蛋白后的多糖溶液進行脫色,并尋求最佳的脫蛋白和脫色工藝,為進一步分離純化芒果皮渣多糖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

臺農1號芒果 購自廣西百色;粉末活性炭 廣東韓研活性炭制造有限公司;HPD100、HPD-100A、HPD300、AB-8、X-5、D3520、D4020、S-8、NKA-9、NKA-II大孔吸附樹脂 鄭州華溢科技新材料股份有限公司;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(G-250) 美國Sigma公司;木瓜蛋白酶 Solarbio公司;葡萄糖、苯酚、三氯乙酸、鹽酸 天津市福晨化學試劑廠;濃硫酸 廉江市愛廉化試劑有限公司;無水乙醇、正丁醇、30% H2O2天津市富宇精細化工有限公司;氯仿、丙酮 廣州蘇喏化工有限公司。

DHG 9140A電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;GL-20G-II高速冷凍離心機 美國Thermo公司;EL 104電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;RE-3000B旋轉蒸發儀 德國海道爾夫公司;FD-1C-50型真空冷凍干燥機 上海喬躍電子有限公司;UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司;MAXQ800型恒溫搖床 美國Thermo公司;79-1型磁力攪拌器 新康醫療器械有限公司;SHZ-D(III)循環水式多用真空泵 鞏義市英峪高科儀器;HH-4恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 芒果皮渣多糖的制備 取成熟、無腐爛的芒果皮渣,清洗,55 ℃烘干24 h,粉碎,過40目篩,備用。稱取一定重量的芒果皮渣粉,以蒸餾水為提取劑,按照本實驗室優化的工藝參數進行提取(料液比1∶40 g/mL、水浴溫度98 ℃,水浴時間4 h),隨后以6000 r/min離心10 min,收集上清液,殘渣重復提取1次。合并上清液,減壓濃縮至原體積1/5,加入濃縮液4倍體積95%乙醇,4 ℃靜置過夜,3000 r/min離心10 min,沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌2～3次,冷凍干燥即得芒果皮渣粗多糖。

1.2.2 芒果皮渣多糖脫蛋白

1.2.2.1 不同脫蛋白方法的比較 配制5 mg/mL芒果皮渣多糖溶液,取30 mL,分別采用9種不同的方法進行脫蛋白。

三氯乙酸(TCA)法[16]:加入30 mL 20% TCA(m/V),160 r/min振蕩2 h,4000 r/min離心10 min,取上清液分別測定蛋白質含量和多糖含量。

TCA-正丁醇法[17-18]:加入60 mL TCA-正丁醇溶液[TCA(20%)∶正丁醇=1∶10 (V/V)],160 r/min振蕩2 h,倒入分液漏斗中靜置2 h,待分層后取下層溶液,分別測定蛋白質含量和多糖含量。

Sevage法[19]:加入7.5 mL Sevage試劑[氯仿∶正丁醇=4∶1(V/V)],180 r/min振蕩60 min,4000 r/min離心10 min,棄去下層有機相和中間層膠狀變性蛋白質,取上層溶液分別測定蛋白質含量和多糖含量。

TCA+Sevage法:用TCA法脫除一次,再用Sevage法脫除一次,分別測定蛋白質含量和多糖含量。

木瓜蛋白酶法[20]:配制1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液,取1.5 mL加入到多糖溶液中,調節pH為6.5,65 ℃水浴振蕩水解3 h,沸水浴滅酶5 min,冷卻后4000 r/min離心10 min,取上清液分別測定蛋白質含量和多糖含量。

木瓜蛋白酶+Sevage法[21]:用木瓜蛋白酶法脫除一次,再用Sevage法脫除一次,分別測定蛋白質含量和多糖含量。

木瓜蛋白酶+TCA法[26]:依次用木瓜蛋白酶法和TCA法脫蛋白,分別測定蛋白質含量和多糖含量。

木瓜蛋白酶+TCA-正丁醇法[22]:依次用木瓜蛋白酶法和TCA-正丁醇法脫蛋白,分別測定蛋白質含量和多糖含量。

HCl法[23]:加入30 mL 1 mol/L HCl,160 r/min振蕩2 h,4000 r/min離心10 min,取上清液分別測定蛋白質含量和多糖含量。

1.2.2.2 TCA-正丁醇法脫蛋白工藝優化 選取對TCA-正丁醇法脫蛋白效果影響較大的3個因素TCA-正丁醇與樣液體積比(A)、TCA與正丁醇體積比(B)和振蕩時間(C),按L9(34)正交表安排實驗,因素水平見表1。數據處理采用綜合加權評分法[24],評分標準為:分別測定蛋白質脫除率和多糖保留率,將各項指標除以該列最大值再乘以100,為該項得分,設定蛋白質脫除率和多糖保留率兩者的權重系數均為0.5,對兩項指標進行加權求和,按下式計算綜合評分。

式中,X為蛋白質脫除率,Y為多糖保留率,Xmax為蛋白質脫除率最大值,Ymax為多糖保留率最大值。

表2 活性炭脫色單因素實驗Table 2 Univariate experiments on decoloration by active carbon

表1 TCA-正丁醇法脫蛋白正交實驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test on deproteinzation by TCA-n-butanol method

1.2.3 活性炭脫色

1.2.3.1 單因素實驗 取20 mL經TCA-正丁醇法脫蛋白后的多糖溶液,以脫色率和多糖保留率為評價指標,分別探討活性炭添加量、脫色溫度、脫色時間和樣液pH對芒果皮渣多糖溶液脫色效果的影響,每個水平做3個重復。其單因素實驗水平設計見表2。

1.2.3.2 正交實驗 根據單因素實驗結果,選取脫色溫度(D)、脫色時間(E)、活性炭添加量(F)、樣液pH(G)4個因素,每個因素設置3個水平,按L9(34)正交表設計實驗(見表3),以脫色率和多糖保留率為考察指標進行條件優化。進行綜合評分時以指標的最大值為參照將數據進行歸一化,脫色率和多糖保留率的權重系數各為0.5。

表3 活性炭脫色正交實驗因素水平表Table 3 Factors and levels of orthogonal test on decoloration by active carbon

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 多糖保留率的測定 采用苯酚-硫酸法[25]測定多糖含量。以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程:y1=0.0110x1-0.0002,式中x1為葡萄糖濃度,y1為吸光度,R2=0.9994,線性范圍為0～0.07 mg/mL。多糖保留率按下式計算。

多糖保留率(%)=脫蛋白(脫色素)后多糖含量/脫蛋白(脫色素)前多糖含量×100

式(1)

1.2.4.2 蛋白質脫除率的測定 采用考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質含量。以牛血清白蛋白標準品含量為橫坐標,于595 nm處測得的吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線,得到回歸方程y2=0.0007x2+0.0057,式中x2為蛋白質含量,y2為吸光度,R2=0.9996,即蛋白質含量在0～1.0 mg范圍內與吸光度呈現良好的線性關系。蛋白質脫除率按下式計算。

蛋白質脫除率(%)=脫蛋白前蛋白質含量-脫蛋白后蛋白質含量/脫蛋白前蛋白質含量×100

式(2)

1.2.4.3 脫色率的測定 將經TCA-正丁醇法脫蛋白后的芒果皮渣多糖溶液于200～600 nm波長范圍內進行紫外-可見光譜全波長掃描,結果表明多糖溶液在310 nm下有最大吸收峰,故選擇310 nm為檢測波長測定芒果皮渣多糖溶液脫色前后的吸光度,并按下式計算脫色率。

脫色率(%)=脫色前吸光度-脫色后吸光度/脫色前吸光度×100

式(3)

2 結果與分析

2.1芒果皮渣多糖脫蛋白

2.1.1 不同脫蛋白方法的比較 由圖1可知,9種方法對芒果皮渣多糖均有一定的脫蛋白效果,但在脫除蛋白質的同時,造成不同程度的多糖損失。從脫蛋白效果來看,TCA-正丁醇法和木瓜蛋白酶+TCA-正丁醇結合法對粗多糖中蛋白質脫除效果較好,脫除率均高于80%,且后者稍高于前者,這可能是由于蛋白酶除了酶解多糖溶液中的游離蛋白質外,還對與多糖結合的蛋白質產生了酶解作用。從多糖的損失方面來看,木瓜蛋白酶+TCA-正丁醇結合法略高于TCA-正丁醇法,這可能是由于多次操作造成部分多糖損失。此外,TCA法、TCA+Sevage法、HCl法和木瓜蛋白酶+TCA法對芒果皮渣多糖的蛋白質脫除率均高于45%,但多糖損失嚴重;而Sevage法、木瓜蛋白酶法和木瓜蛋白酶+Sevage法的多糖損失較少,但脫蛋白效果較差,脫除率均低于10%。綜上所述,選擇TCA-正丁醇法對芒果皮渣多糖進行脫蛋白處理。

圖1 不同方法對蛋白質脫除率與多糖保留率的影響Fig.1 Effect of different methods on the rate of deproteinization and polysaccharide retention

表4 TCA-正丁醇法脫蛋白正交實驗結果Table 4 Results of orthogonal test on deproteinization by TCA-n-butanol

表5 方差分析和顯著性檢驗結果Table 5 Results on analysis of variance and significance test

注:F0.05(2,2)=19.00;F0.01(2,2)=99.00;**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05);表7同。

2.1.2 TCA-正丁醇法脫蛋白工藝條件優化 由表4可知,影響TCA-正丁醇法脫蛋白效果的因素大小順序為:A>B>C,即TCA-正丁醇與樣液的體積比對脫蛋白效果影響最大,其次為TCA與正丁醇的體積比,振蕩時間對脫蛋白效果影響最小。TCA-正丁醇法脫蛋白的最佳工藝條件為A1B3C2,即TCA-正丁醇與樣液體積比為2∶1,三氯乙酸與正丁醇體積比為1∶20,振蕩時間為2 h。對正交實驗結果進行方差分析,結果如表5所示。由表5可知,因素A、B對蛋白質脫除率有非常顯著的影響,因素C對蛋白質脫除率有顯著影響。在最佳工藝條件下進行3次驗證實驗,得出蛋白質脫除率為90.08%,多糖保留率為96.40%,此時綜合得分為99.90。

2.2活性炭脫色工藝研究

2.2.1 活性炭添加量對芒果皮渣多糖脫色效果的影響 由圖2可知,隨著活性炭添加量的增加,脫色率不斷增大,當活性炭添加量大于1.0%時,脫色率增大趨勢減緩。而多糖保留率隨著活性炭添加量的增加呈逐漸降低的趨勢,綜合考慮,選擇活性炭添加量為1.0%。

圖2 活性炭添加量對脫色率和多糖保留率的影響Fig.2 Effect of amounts of active carbon on decoloration and polysaccharide retention

2.2.2 脫色溫度對芒果皮渣多糖脫色效果的影響 由圖3可知,隨著脫色溫度的升高,脫色率呈先增大后減小趨勢,當溫度為50 ℃時,脫色率達到最大。脫色溫度在30～40 ℃內,多糖保留率顯著增加,當溫度為40 ℃時,多糖保留率達到最大,此后繼續升高溫度,多糖保留率逐漸降低。這可能是因為溫度較低,分子擴散運動不明顯,色素分子與活性炭不能很好的接觸吸附;溫度過高,部分多糖喪失活性,進而影響多糖含量。綜合考慮,選擇脫色溫度為50 ℃。

圖3 脫色溫度對脫色率和多糖保留率的影響Fig.3 Effect of decolorating temperature on decoloration and polysaccharide retention

2.2.3 脫色時間對芒果皮渣多糖脫色效果的影響 由圖4可知,隨著脫色時間的延長,脫色率呈先增加后減小趨勢,當脫色時間為60 min時,脫色率達到最大;多糖保留率隨著脫色時間的延長緩慢降低,在60～100 min的范圍內降低趨勢較平緩,這可能是由于多糖被活性炭產生吸附的緣故。綜合考慮選擇最佳脫色時間為60 min。

圖4 脫色時間對脫色率和多糖保留率的影響Fig.4 Effect of decolorating time on decoloration and polysaccharide retention

2.2.4 樣液pH對芒果皮渣多糖脫色效果的影響 由圖5可知,在測定pH范圍內,脫色率隨著樣液pH的增加逐漸降低。樣液pH在3.0～5.0范圍內,多糖保留率顯著增加,pH為5.0時,多糖保留率達到最大;此后繼續增大樣液pH,多糖保留率變化不大。以上結果表明酸性條件有利于活性炭的吸附脫色作用,而多糖在堿性條件下比在酸性條件下穩定。綜合考慮脫色率和多糖保留率,選擇樣液pH為3.0～5.0來開展后續實驗。

表6 活性炭脫色正交實驗結果Table 6 Results of orthogonal test on decoloration by active carbon

圖5 樣液pH對脫色率和多糖保留率的影響Fig.5 Effect of sample pH on decoloration and polysaccharide retention

2.2.5 正交實驗結果 由表6和表7分析可知,影響活性炭脫色綜合評分的因素大小順序為:D>F>E>G,即脫色溫度對綜合評分影響最大,其次為活性炭添加量,再次是脫色時間,樣液pH對脫色效果影響最小。活性炭脫色的最佳工藝條件為D2E3F3G1,即脫色溫度50 ℃,脫色時間75 min,活性炭添加量1.5%,樣液pH3.0。按優化的工藝條件進行3次驗證實驗,得到脫色率為70.98%,多糖保留率為92.77%,綜合評分為93.66,表明實驗所確定的工藝條件為最優脫色工藝條件。

3 結論

本實驗采用9種不同的方法對實驗室自制的芒果皮渣多糖進行脫蛋白研究,結果表明TCA-正丁醇法的脫蛋白效果較好。

表7 活性炭脫色方差分析表Table 7 Analysis of variance of decoloration by active carbon

為探索TCA-正丁醇法脫蛋白的適宜條件,選取TCA-正丁醇與樣液體積比、TCA與正丁醇體積比、振蕩時間3個因素安排正交實驗,結果發現3個因素對脫蛋白效果的影響主次順序為:TCA-正丁醇與樣液體積比>TCA與正丁醇體積比>振蕩時間,適宜的脫蛋白工藝為TCA-正丁醇與樣液體積比2∶1,TCA與正丁醇體積比1∶20,振蕩時間2 h,在此條件,蛋白質脫除率為90.08%,多糖保留率為96.40%。采用活性炭對經TCA-正丁醇法脫蛋白后的多糖溶液進行脫色處理,分別考察了脫色溫度、脫色時間、活性炭添加量和樣液pH對脫色效果的影響,在單因素實驗的基礎上通過正交實驗優化最佳脫色工藝,結果表明,當調節樣液pH為3.0,添加1.5%的活性炭,50 ℃振蕩吸附75 min,脫色率為70.98%,多糖保留率為92.77%。本方法降低了粗多糖中蛋白質和色素含量,改善了其外觀,提高了多糖的純度,為后續芒果皮渣多糖的進一步研究提供了參考。

[1]孫延芳,梁宗鎖,張欣,等. 芒果多糖的純化與光譜分析[J]. 食品科學,2012,33(7):93-95.

[2]王維民,汪敏. 芒果皮粗多糖提取的影響因素及工藝的研究[J]. 農產品加工·學刊,2005,9(2):128-131.

[3]RN Tharanathan,HM Yashoda,TN Prabha. Mango,“the king of fruits”-an overview[J]. Food Reviews International,2006,22(2):95-123.

[4]Prassana V,Prabha T N,Tharanathan R N. Pectic polysaccharides of mango(MangiferaindicaL.):structural studies[J]. Journal of the Science of Food & Agriculture,2004,84(13):1731-1735.

[5]Chen Y,Luo H,Gao A,et al. Extraction of polysaccharides from mango(MangiferaindicaLinn)seed by response surface methodology and identification of their structural characteristics[J]. Food Analytical Methods,2012,5(4):800-806.

[6]Airianah O B,Vreeburg R A M,Fry S C. Pectic polysaccharides are attacked by hydroxyl radicals in ripening fruit:evidence from a fluorescent fingerprinting method[J]. Annals of Botany,2016,117(3):441-455.

[7]Sadeq H A S,Amin I,Mohd Y M,et al. Purification,characterization and antioxidant activity of polysaccharides extracted from the fibrous pulp of Mangifera pajang fruits[J]. LWT-Food Science and Technology,2012,2(48):291-296.

[8]Maran J P,Swathi K,Jeevitha P,et al. Microwave-assisted extraction of pectic polysaccharide from waste mango peel[J].

Carbohydrate Polymers,2015,123:67-71.

[9]Fahmy S R,Amien A I,Abd-Elgleel F M,et al. Antihepatotoxic efficacy of Mangifera indica L. polysaccharides against cyclophosphamide in rats[J]. Chemico-Biological Interactions,2016,244:113-120.

[10]Alok P,Keerthana V,Kumar J C,et al. Antibacterial property of two different varieties of Indian mango(Mangiferaindica)kernel extracts at various concentrations against some human pathogenic bacterial strains[J]. International Research Journal of Biological Science,2013,2:28-32.

[11]李小蓉,黃毓娟,權彥. 倒卵葉五加多糖脫色工藝研究[J]. 食品工業科技,2013,24(4):296-299.

[12]屈小玄,鄭永清,呂遠平. 猴頭菇多糖脫蛋白方法的比較研究[J]. 食品科技,2015,40(9):170-175.

[13]賈淑珍,王成忠,于功明. 香菇多糖脫色方法的研究[J].食品科技,2007,36(6):113-115.

[14]楊大偉,吳永堯,唐巧玉. 碎米薺多糖的過氧化氫脫色方法研究[J]. 食品科技,2008,33(1):174-177.

[15]張叢叢,王瑩,樸美子. 響應面法優化黃秋葵多糖脫色工藝[J]. 食品工業科技,2014,35(19):251-256.

[16]郭思維,劉勝姿,李威,等. 人工冬蟲夏草多糖脫色脫蛋白工藝研究[J]. 食品科技,2013,38(5):207-211.

[17]李錦運. 冷破碎蘋果皮渣中多糖的提取、分離純化及抗氧化性研究[D]. 西安:陜西師范大學,2011.

[18]李艷紅. 山植多糖的提取、分離純化及結構研究[J]. 太原:山西大學,2006.

[19]于曉紅. 西洋參多糖結構表征及免疫活性研究[D]. 哈爾濱:哈爾濱理工大學,2016.

[20]劉小攀,田啟建,田春蓮. 黃精多糖酶法脫蛋白的工藝研究[J]. 西北林學院學報,2016,31(1):238-242.

[21]方婷,曾紅亮,陳曉垚,等. 豬肚菇粗多糖脫蛋白脫色工藝優化研究[J]. 熱帶作物學報,2015,36(6):1166-1172.

[22]汪艷群,孟憲軍,李冬男,等. 五味子多糖脫蛋白工藝的研究[J]. 食品工業科技,2011,37(3):280-284.

[23]郭育東,單斌,李敏儀. 苦瓜多糖脫蛋白方法的比較研究[J]. 安徽農業科學,2009,37(7):3225-3227.

[24]廖春燕,許海潤,黃瑤. 貓須草多糖脫蛋白脫色工藝[J]. 廣西科技大學學報,2016,27(4):111-115.

[25]李金花,農石生,韋柳培,等. 芒果葉多糖的提取及含量測定[J]. 食品研究與開發,2012,33(3):135-137.

[26]何沂飛,劉平懷,黃良果,等. 庫拉索蘆薈凝膠多糖脫蛋白方法研究[J]. 食品工業科技,2014,35(17):190-192.