響應面法優化龍膽草多糖的脫色工藝

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(貴州師范大學化學與材料科學學院,貴州貴陽 550001)

龍膽草是龍膽科植物三花龍膽(GentianatrifloraPall.)、堅龍膽(GentianariescensFranch)、條葉龍膽(GentianamaushurieaKitag)或龍膽(GentianaseabraBye)干燥的根和根莖[1]。在我國主要分布于東北三省、內蒙古、湖南、湖北、浙江、云南、貴州、廣西和四川等地,國外主要產于朝鮮和日本[2]。龍膽草具有清熱燥濕、清肝瀉膽的功效[2]。多糖為龍膽中一種有效成分[3],龍膽多糖具有許多生理活性,如具有降血脂[4]、抗凝血[5]、抗氧化[6]、抗腫瘤[1]、保肝利膽、免疫調節[7-9]等作用。

在提取龍膽多糖的過程中,色素也很容易被提取出來,所以龍膽粗多糖的顏色較深。一方面色素的存在會影響多糖的活性,另一方面由于后續工作通常要利用離子交換層析和凝膠柱層析對龍膽多糖進行分離純化[10-11],在上柱前通常需要去除粗多糖中的色素,否則色素會增大多糖分離純化的技術難度[12]。目前對龍膽多糖脫色的文獻較少,相關的報道只有H2O2脫色法、AB-8大孔吸附樹脂靜態脫色法、活性炭法[11]。研究發現聚酰胺能對一些多糖溶液進行脫色,比如對駿棗多糖[13]、綠茶多糖[14]、樺褐孔菌多糖[15]、金針菇多糖[16]、獼猴桃根多糖[17]、竹葉多糖[18]、阿魏菇多糖[19]等植物多糖均有較好的脫色效果。一般來說,植物色素為羥基蒽醌衍生物、酚類等小分子物質,這些物質可以和聚酰胺通過氫鍵締合,這種締合能力比聚酰胺與多糖的結合能力強,所以在水溶液中首先被吸附[20]。而且由于聚酰胺不但可以吸附色素,還可以最大限度地保持多糖的活性,價格便宜,是一種高效率、低成本的方法[18]。目前還沒有利用聚酰胺對龍膽多糖進行脫色的相關報道,因此本文以黔產龍膽草為原料提取多糖,在單因素實驗的基礎上,采用響應面法優化聚酰胺柱層析脫色法,得到最佳脫色工藝,并對聚酰胺樹脂的重復利用性進行研究,旨在為龍膽草多糖的初步純化提供理論數據。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

龍膽草 購于貴州濟仁堂,產地為貴州;聚酰胺樹脂(30～60目) 鄭州勤實科技有限公司;其它試劑均為國產分析純。

101-1A 型干燥箱 天津泰斯特公司;A200S型電子天平 德國科恩公司;SHB-IIIA型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿公司;U V 2300型分光光度計 上海天美科學儀器公司;FZ 102 型植物粉碎機 天津市泰斯特公司。

1.2實驗方法

1.2.1 龍膽草多糖的提取 提取方法參考文獻[21]并做修改。將龍膽草用去離子水洗凈、烘干并粉碎,過40目篩,乙醚回流脫脂,揮干乙醚并干燥。在80 ℃熱水中浸提2 h(料液比1∶30),減壓過濾后取清液,將清液濃縮至原體積的1/5,加入3倍體積的無水乙醇,冰箱中靜置24 h,抽濾,依次用丙酮、無水乙醇洗滌沉淀,自然風干,得到龍膽草粗多糖,并按照下式計算多糖得率。

多糖得率(%)=(粗多糖質量/藥材質量)×100

1.2.2 聚酰胺的預處理 聚酰胺處理方法參考文獻并略作修改[22],向聚酰胺樹脂中加入濃度為95%的乙醇,所加乙醇的體積為樹脂體積的3倍,浸泡24 h,然后用蒸餾水洗滌至聚酰胺無乙醇味,再加入4%的NaOH浸泡2 h,用蒸餾水洗滌至中性,再用4%的HCl浸泡2 h,用蒸餾水洗滌至中性,用蒸餾水浸泡以備用。

1.2.3 單因素實驗 在預實驗的基礎上選取龍膽草多糖的上樣體積、上樣濃度、上樣流速三個因素對聚酰胺脫色的影響進行研究。

1.2.3.1 上樣體積對聚酰胺脫色的影響 取30 mL處理好的聚酰胺濕法裝入9根規格相同的層析柱中,分別以1、2、3、4、5、6、7、8、9 BV的上樣體積進樣,固定上樣濃度為6 mg/mL,上樣流速為2 BV/h。在450 nm與490 nm處測吸光度,測定龍膽多糖溶液的脫色率和多糖保留率,以及綜合評分OD值。

1.2.3.2 上樣流速對聚酰胺樹脂脫色的影響 取30 mL處理好的聚酰胺濕法裝入5根規格相同的層析柱中分別以0.5、1、2、3、4 BV/h的流速上樣,固定上樣濃度為6 mg/mL,上樣體積為5 BV。在450 nm與490 nm處測吸光度,并計算龍膽多糖的脫色率和多糖保留率,以及綜合評分OD值。

1.2.3.3 上樣濃度對聚酰胺脫色的影響 取30 mL處理好的聚酰胺濕法裝入5根規格相同的層析柱中,分別以2、3、4、5、6 mg/mL的濃度上樣,固定上樣體積為5 BV,上樣流速為2 BV/h。在450 nm與490 nm處測吸光度,并計算龍膽多糖的脫色率和多糖保留率,以及綜合評分OD值。

1.2.4 響應面實驗設計 在單因素實驗的基礎上,按照Box-Behnken的中心組合設計原理,選取上樣體積(X1)、上樣流速(X2)、上樣濃度(X3)為響應因素,以龍膽草多糖脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)綜合得出的綜合評分(OD)為響應值。設計三因素三水平的Box-Behnken實驗,通過Design-Expert設計軟件,對龍膽草多糖樹脂脫色工藝進行優化。因素水平表見表1。

表1 響應面分析法的因素水平表Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.2.5 聚酰胺的再生及其再生后脫色能力考察 將聚酰胺按優化條件得到的最佳脫色條件進行脫色,將使用過的聚酰胺進行再生處理,處理方法同“1.2.2”中的聚酰胺預處理方法一樣。樹脂反復使用5次,每一次均測定多糖脫色后的脫色率和多糖保留率,以此考察聚酰胺的再生能力。

1.2.6 指標的測定

1.2.6.1 多糖保留率的測定方法 參考文獻[23]采用硫酸-苯酚法繪制葡萄糖標準曲線,曲線為y=0.0502x+0.0235,R2=0.9997,線性范圍在0～10 μg/mL。并測定龍膽多糖脫色前后的多糖含量,計算出多糖保留率。

多糖保留率(%)=(脫色后多糖質量/脫色前多糖質量)×100

1.2.6.2 多糖脫色率的測定方法 將龍膽草多糖樣品溶液適當稀釋,在200～800 nm范圍內進行全波長掃描,以確定該色素的最大吸收波長,掃描結果顯示龍膽草多糖樣液在可見光區無最大吸收,根據光的互補色原理,溶液本身所呈的顏色即為它吸收光的互補色,由于龍膽草多糖溶液為橙黃色,所以判斷溶液主要吸收藍色波段的可見光。因此本實驗選擇藍色波段中心波長為檢測波長,即測定450 nm處該溶液的吸光度A[24],并計算出脫色率。

1.2.6.3 OD值的計算 以龍膽草多糖脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)為指標,兩個指標的權重系數均為0.5,按照綜合評判公式計算出歸一值OD=MY1+NY2,其中M、N分別為龍膽多糖脫色率(Y1)和多糖保留率(Y2)的權重系數,且M和N值均為0.5[25-26]。

1.2.7 數據處理 實驗所有數據為三次重復實驗的平均值,結果以平均值±標準偏差表示;采用Origin9.0作圖;采用DesignExpert8.0.6.1軟件中的Box-Behnken Design(BBD)響應面優化分析。

2 結果與討論

2.1單因素實驗結果

2.1.1 上樣體積對脫色效果的影響 在一定的上樣濃度和上樣流速條件下,以不同的龍膽草多糖溶液上樣體積(1、2、3、4、5、6、7、8、9 BV)進行脫色實驗,結果如圖1和圖2所示。從圖1中可知,脫色率隨著上樣體積的增加而逐漸減少,當上樣體積為1 BV時,脫色率為98.04%±0.31%,當上樣體積為9 BV時,脫色率為58.98%±0.41%。這可能是由于上樣體積達到了一定程度,樹脂已經達到了最大的處理量,所以上樣體積再增大,脫色效率會降低[27];而隨著上樣體積的增大,多糖保留率隨之增大,但在上樣體積大于5 BV時,增大的趨勢有所減少。當上樣體積為1 BV時,多糖保留率較低,僅為11.97%±0.34%,而上樣體積為9 BV時,多糖保留率可達78.26%±0.56%。所以上樣體積太小或太大都不合適。從圖2可以看出,綜合評分OD值隨著上樣體積的增加呈先增大后減小的趨勢。當上樣體積為5 BV時,綜合評分OD值最大,綜合考慮脫色率、多糖保留率和綜合評分OD值,選擇5 BV為龍膽多糖脫色較適宜的上樣體積。

圖1 上樣體積對脫色效果的影響Fig.1 Effect of sample volume on the decolorization effect rate

圖2 上樣體積對OD值的影響Fig.2 Effect of sample volume on the OD value

2.1.2 上樣流速對聚酰胺樹脂脫色的影響 在上樣體積和上樣濃度一定的條件下,以不同的上樣流速(0.5、1、2、3、4 BV/h)進行脫色實驗,結果如圖3和圖4所示。隨著流速的增加,脫色率呈迅速下降的趨勢,這可能是流速加快了,使龍膽多糖色素與樹脂的接觸時間縮短,而使樹脂對色素的吸附能力降低了[28];而隨著流速的增加,多糖保留率則呈上升趨勢,這可能是由于流速快能縮短上柱液在樹脂柱中的擴散,使多糖樣液能迅速流出樹脂柱,從而使多糖保留率提高[29]。當上樣流速為0.5 BV/h時,脫色率為83.22%±0.39%,多糖保留率為75.00%±0.29%,當上樣流速為4 BV/h時,脫色率為75.58%±0.15%,多糖保留率為87.76%±0.20%。從圖4可以看出,綜合評分OD值隨著上樣流速的增加呈先較快增加,再緩慢下降的趨勢,當上樣流速為2 BV/h時,綜合評分OD值為最大。綜合考慮脫色率、多糖保留率和綜合評分OD值,選擇2 BV/h為龍膽多糖脫色的較適宜的上樣流速。

圖3 上樣流速對脫色效果的影響Fig.3 Effect of flow rate on the decolorization effect rate

圖4 上樣流速對OD值的影響Fig.4 Effect of flow rate on the OD value

圖5 上樣濃度對脫色效果的影響Fig.5 Effect of sample concentration on the decolorization rate

2.1.3 上樣濃度對聚酰胺樹脂脫色的影響 在上樣流速和上樣體積固定的條件下,以不同濃度的龍膽多糖溶液(2、3、4、5、6 mg/mL)進行脫色實驗,結果見圖5和圖6所示。隨著上樣濃度的增大,脫色率呈降低的趨勢,當濃度大于4 mg/mL時,脫色率下降的趨勢加快;隨著上樣濃度的增高,多糖保留率呈升高的趨勢。當上樣濃度為2 mg/mL時,脫色率為84.30%±0.16%,多糖保留率為68.43%±0.26%,而當上樣濃度為6 mg/mL時,脫色率為70.40%±0.16%,多糖保留率為90.70%±0.11%。這可能是樹脂對多糖和色素的吸附能力有一定的極限,上樣濃度太大則會超過樹脂的最大處理量,從而導致隨著上樣濃度的增加,脫色率減小而多糖保留率增加。從圖6可以看出,綜合評分OD隨著上樣濃度的增加呈現先增加,再緩慢減小的趨勢,當上樣濃度為4 mg/mL時,綜合評分OD值為最大。因此綜合考慮脫色率、多糖保留率和綜合評分OD值,選擇4 mg/mL為龍膽多糖的較適宜的上樣濃度。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

圖6 上樣濃度對OD值的影響Fig.6 Effect of sample concentration on the OD value

注:*表示影響顯著(p<0.05);**表示影響極顯著(p<0.01)。

2.2響應面實驗結果與數據分析

2.2.1 Box-Behnken實驗結果 根據表1中的因素水平值,利用Design-Expert8.0.6軟件設計出實驗方案,方案中共有17個實驗點,其中有5組是零點,12組是析因點。實驗方案和結果見表2。

表2 響應面法的實驗設計及結果Table 2 Expertmental design and results of response surface analysis

對所得實驗數據進行多元擬合分析,建立二次響應面回歸方程,本實驗以龍膽草多糖脫色率和多糖保留率算出的歸一值(OD)為響應值,由此得到龍膽草多糖脫色率和上樣體積、上樣濃度和上樣流速的二次多項回歸模型為:

OD=0.87-9.850×10-3X1-0.01X2-0.030X3-4.750×10-4X1X2+9.075×10-3X1X3-0.025X2X3-0.062(X1)2-0.053(X2)2-0.042(X3)2

該回歸模型中的一次項X3、二次項X12、X22和X32對OD值的影響極顯著。說明上樣濃度對龍膽草多糖脫色工藝影響極顯著,上樣流速和上樣體積對龍膽草多糖脫色工藝的影響不顯著。各因素對龍膽草多糖脫色工藝的影響大小順序為:上樣濃度(X3)>上樣流速(X2)>上樣體積(X1)。

圖7 各因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of various hydrolysis conditions

2.2.2 響應面圖的分析 響應面法可以通過固定次數的實驗對實驗因素進行分析,得到較直觀的3D圖形,從而可以評價各因素之間的交互作用,響應面圖彎曲度越大,表明兩因素間越顯著[24]。此外,等高線的形狀也可以反映因素之間交互作用的強弱,如橢圓形表示兩因素交互作用顯著,圓形則表示交互作用不顯著[30]。通過對響應面的陡峭程度分析,上樣濃度對OD值的影響最大,其次是上樣流速和上樣體積;通過對等高線的分析發現,上樣濃度和上樣流速的等高線為橢圓形,說明這兩個因素交互作用顯著。而上樣體積和上樣流速的等高線與上樣體積和上樣濃度的等高線為圓形,所以說明上樣體積和上樣流速交互作用不顯著,上樣體積和上樣濃度交互作用不顯著。這與方差分析結果一致。

2.2.3 響應面分析和最優脫色條件的確定 回歸模型中的OD最大估計值為0.8794,與之對應的自變量上樣體積(X1)為4.89 BV,上樣流速(X2)為1.99 BV/h,上樣濃度(X3)為3.63 mg/mL。為了檢驗該條件的可靠性,需要進行驗證實驗,考慮到實際操作的可行性,將工藝條件改為上樣體積為5 BV,上樣流速為2 BV/h,上樣濃度為3.50 mg/mL,測得龍膽草多糖的脫色率(Y1)為80.60%±0.91%,多糖保留率(Y2)為86.28%±0.67%,算出其OD值為0.8344。理論預測值和實測值相比,誤差較小,相對誤差為-5.12%,說明本實驗建立的二次多項回歸模型可以很好地預測因素和響應值之間的變化關系。

2.3聚酰胺再生后的脫色效果

隨著聚酰胺使用次數的增加,上面會殘留許多雜質,使柱體顏色加深且柱效降低,所以要對其處理再生。由圖8可以看出,再生聚酰胺脫色效果隨著使用次數的增加而緩慢降低,而多糖保留率隨著使用次數的增加而略有增加,重復使用5次后,脫色率為76.85%±0.59%,多糖保留率為98.32%±0.37%。這有可能是由于聚酰胺使用后會產生一些死體積而造成對色素和多糖的吸附能力降低,而使脫色率下降,多糖保留率升高。聚酰胺在使用5次以后,脫色效果降低的幅度較小,該樹脂對龍膽多糖的脫色具有良好的實用價值,再生效果較好。

圖8 再生聚酰胺對脫色效果的影響Fig.8 Effect on decolorization rate of polyamide regeneration

3 結論

在單因素實驗的基礎上,通過Box-Behnken實驗設計方法對龍膽脫色進行3因素3水平設計,以綜合評分OD值為響應值,并用Design Expert 8.0.6對數據進行處理。實驗結果得到采用聚酰胺對龍膽多糖的最佳脫色工藝為:上樣體積為5 BV,上樣流速為2 BV/h,上樣濃度為3.50 mg/mL。在此條件下進行驗證實驗,測得多糖保留率為86.28%±0.67%,脫色率為80.60%±0.91%,與理論值接近,表明模型可靠。

再生聚酰胺的脫色實驗表明,聚酰胺在使用5次以后,脫色率下降為76.85%±0.59%,而多糖保留率明顯升高,升高到98.32%±0.37%。說明聚酰胺多次使用后脫色效果還是比較明顯,適于回收利用,減低成本。此法簡單可行,可為龍膽多糖的初步純化提供依據。

本實驗僅研究了聚酰胺對龍膽粗多糖的脫色效果和工藝,沒有研究聚酰胺對龍膽粗多糖中其他雜質的吸附效果。此外,利用聚酰胺對龍膽粗多糖脫色后是否會影響其生物活性也尚未可知,所以今后還應該對這方面進行深入研究。

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