中國傳統豆制品中異黃酮的超高效液相色譜-紫外檢測器快速定量法

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(1.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122;2.江南大學食品安全國際合作聯合實驗室,江蘇無錫 214122;3.瑪氏食品(中國)有限公司，北京 101407)

大豆異黃酮是大豆生長過程中形成的次級代謝產物,具有調節體內激素水平、蛋白質合成、生長因子活性、代謝生物學活性等生理功能[1-3]。亞洲,尤其是中國,大豆制品是人民日常膳食的重要組成。中國是大豆的故鄉，我國人民利用大豆研制了種類豐富的豆制品，如素雞、豆腐、豆漿、百葉等，其中大部分豆制品為中國獨有的特色食品。隨著健康意識的提升,2010-2012年間調查顯示,我國每人每天居民豆類及豆制品的攝入量約為10.9 g,但遠沒有達到我國平衡膳食寶塔建議(30～50 g),這說明豆制品未來在我國市場仍具有巨大的發展潛力[4]。因此,對我國傳統豆制品中大豆異黃酮的定性定量方法學研究,對豆制品工業生產工藝的提高、產品的質量控制及營養評估均有重要意義。

自然界中的大豆異黃酮主要以游離型的苷元和結合型的糖苷兩種形式存在,主要包括三種苷元(大豆苷、大豆苷元、染料木素),苷元的三種7-O-葡萄糖苷,三種6″-O-丙二酰葡萄糖苷和三種6″-O-乙?；咸烟擒?共12種結構[5]。已報道的異黃酮定量分析包括紫外分光光度法、三波長法、高效液相法(HPLC)、超高效液相色譜法(UHPLC)、液相色譜質譜法(LC MS)等[6-9]。其中,LC-MS除定量外,還可對未知異黃酮成分進行結構推測,但由于價格昂貴,不為實驗室廣泛配備[10-13]。HPLC具有準確、快速、靈敏度高等優勢,已被各單位廣泛配置[6,8,14],因此,目前以HPLC法為主對進行異黃酮定量,分析時間一般為20～40 min之間[6,8,14]。在基于HPLC的分析中,由于丙二?；?、乙?；钠咸烟擒沾蠖巩慄S酮極性相近,需要通過長時間的梯度洗脫來實現分離[6,8,14]。UPLC是在傳統HPLC的制造技術、擴散條件和耐受壓力進行了優化，耐壓達到15000 psi上，匹配小于2 μm顆粒度色譜柱，柱外擴散體積小于15 μL，從而使分析速度、分離效率、分析靈敏度顯著提高[15-16]。然而,在實際應用中,由于丙二酰化和乙?；钠咸烟擒沾蠖巩慄S酮標準樣品價格昂貴且不穩定,在實際生產質控中難以實現對6種丙二酰和乙?；拇蠖巩慄S酮進行標準品直接定量。同時,豆制品加工過程,尤其是熱處理過程會促使丙二?；鸵阴；揎椀钠咸烟擒盏慕到?也可能導致對葡萄糖配基的進一步修飾,從而使豆制品中大豆異黃酮的組成更為復雜[13,17-18]。這意味著即使對12種大豆異黃酮同時進行標準樣品定量也仍有一部分未知異黃酮修飾物含量無法評估。為了更為準確的評估豆制品中大豆異黃酮的含量,利用酸性條件將大豆異黃酮衍生物上葡萄糖配基上的修飾基團去除,使丙二酰化、乙?；捌渌咸烟桥浠揎椀难苌锞D化為對應的葡萄糖苷,從而將豆制品中可能存在的12種以上異黃酮物質降低為6種標準品易得價格相對低廉的三種葡萄糖苷和三種苷元。

本文以中國傳統豆制品豆干、素雞、素百葉、腐竹、內酯豆腐、嫩豆腐和老豆腐為研究對象，利用酸化提取，建立基于超高效液相色譜-紫外檢測器(UPLC-UV)中的大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

大豆苷(daidzin,DAI-G,純度≥98%)、黃豆黃苷(glycitin,純度≥98%)、染料木苷(genistin,純度≥98%)、大豆苷元(daidzein,純度≥98%)、黃豆黃素(glycitein,純度≥98%)、染料木素(genistein,純度≥98%) 上海士鋒生物科技有限公司;色譜純甲醇 美國天地試劑公司;鹽酸 國藥集團化學股份有限公司;超純水(18.2 MΩ);豆干、素雞、素百葉、腐竹、內酯豆腐、嫩豆腐和老豆腐 購于本地華潤萬家超市；乙腈、甲醇、甲酸 色譜純(TEDIA，USA)；實驗用水 Milli-Q超純水；標準儲備液 準確稱取各上述標準品加至50 mL容量瓶中，均用乙腈溶解并稀釋至標線，配制成100 mg/L的標準儲備溶液，4 ℃冷藏保存。

Acquity UPLC超高效液相色譜儀 美國沃特世公司;Acquity UPLC二極管陣列紫外檢測器 美國沃特世公司;Masslynx 4.1工作站 美國沃特世公司;Kinetex-C18超高效液相色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm) 美國沃特世公司；SB-3200D超聲清洗劑 寧波新芝生物公司。

1.2實驗方法

1.2.1 色譜條件 流動相為乙腈和0.1%甲酸。流動梯度洗脫程序:0～0.5 min,10%乙腈;0.5～10 min,10%～45%乙腈;10～12 min,45%～100%乙腈,流速:0.3 mL/min,柱溫:45 ℃,紫外檢測波長260 nm;進樣量1 μL。

1.2.2 標準曲線制作 大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素、染料木素標準儲備溶液分別逐級稀釋，配成濃度分別為0.05、0.1、0.3、0.5、1、5、10、25、50、75、100 mg/L的混合標準溶液，在1.2.1分析條件下檢測各組分含量。

1.2.3 大豆異黃酮提取 酸化提取方法根據José L. Pealvo等[8]建立的方法,并稍加改進。利用天平準確稱取0.10 g固體樣品,溶于10 mL酸化的80%甲醇水提取液(1 mol·L-1HCl),均質5 min,超聲提取5 min,80 ℃下水浴加熱1 h。取上清100 μL,甲醇稀釋10倍后,10000 r/min離心3 min,過0.22 μm濾膜后待測。

2 結果與分析

2.1色譜條件的優化

本實驗中,采用梯度洗脫,有利于提高分離效率,同時有效縮短分析時間。如圖1所示,本實驗中采用乙腈和0.1%甲酸(V/V)在8 min內實現6種大豆異黃酮的基線分離。洗脫峰依次為:大豆苷(3.25 min),黃豆黃苷(3.42 min),染料木苷(4.29 min),大豆黃素(6.03 min),黃豆黃素(6.37 min),染料木素(7.70 min)。在豆制品中,含有極性較強且在260 nm檢測波長下具有紫外吸收的嘌呤堿類化合物[15-17],因此在梯度洗脫起始階段設計了0.5 min的10%乙腈等梯度洗脫階段,使該類化合物在被測物前從色譜柱中洗脫,從而保證檢測結果的準確性,優化色譜峰峰型，避免由于失流出等對大豆異黃酮定量結果產生干擾。

圖1 6種大豆異黃酮標準樣品的色譜圖.Fig.1 The UPLC chromatogram of six standards of Isoflaovnes

2.2線性范圍、檢出限及精密度

利用梯度濃度標準品混合液進樣,以1.2.1中色譜條件檢測,以大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆苷元、黃豆黃素和染料木素6種標準樣品的質量濃度為橫坐標,260 nm檢測波長下測得的色譜峰積分峰面積為縱坐標,建立了6種大豆異黃酮的標準曲線方程。大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷的線性范圍確定為0.3～100 mg/L，大豆苷元和黃豆黃素的線性范圍確定為0.15～50 mg/L，染料木素的線性范圍確定為0.15～250 mg/L。同時通過稀釋法，以信噪比等于3為檢出限，確定了6種大豆異黃酮的檢出限。其中，大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、染料木素的檢出限為0.1 mg/L，黃豆黃素的檢出限為0.08 mg/L，大豆苷元的檢出限為0.05 g/L。

表1 線性方程、線性范圍、相關系數及檢出限Table 1 Linear equations,correlation coefficients and limits of detection

2.3樣品處理與回收率

本實驗采取一步提取法對豆制品中大豆異黃酮進行提取。將提取液中甲醇比例控制在80%,目的為沉淀蛋白,同時防止脂類等非極性雜質的共溶出[18]。加入1 mol·L-1HCl，使樣品中大豆異黃酮修飾物水解，葡萄糖苷配基上的丙二酰和乙酰基等衍生基團解離，生成對應的大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷等三種糖苷型大豆異黃酮[8]，使最終的檢測對象為3種葡萄糖苷和3種異黃酮苷元。為考察方法準確性,以豆腐為對象,設計了3個質量濃度水平的添加收回實驗(n=3)。結果見表2,三個添加水平(0.5, 5, 20 mg/kg)的大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷回收率在96.5%～99.8%之間，三個添加水平(0.1, 1, 5 mg/kg)的大豆苷元、黃豆黃素、染料木素回收率在96.7%～102.3%之間，達到分析測試要求。

表2 豆腐中6種大豆異黃酮的添加回收率Table 2 Recovery rates of six isoflavones in Soymilk and Tofu

2.4豆制品中6種大豆異黃酮的測定

在市場中購買了我國消費者日常生活中最常購買的7種大豆制品,具體為腐竹、豆干、素百葉、素雞、嫩豆腐、老豆腐和內酯豆腐,按1.2方法進行樣品前處理和色譜檢測。7種豆制品樣品出峰如圖2所示，可知本方法可以對6種大豆異黃酮組分實現有效分離，同時可保證6種被測物與其他色譜峰實現基線分離，從而避免對定量結果造成干擾。利用表1中標準曲線方程計算6種大豆異黃酮含量,結果見表3。7種豆制品中總大豆異黃酮的含量分別為，內酯豆腐9.76 g/kg，硬豆腐13.8 g/kg，軟豆腐8.67 g/kg，素百葉14.22 g/kg，豆干16.14 g/kg，素雞16.48 g/kg，腐竹25.83 g/kg。7種豆制品隨機購于市場中，但6種大豆異黃酮中均以大豆苷和染料木苷為主要成分，二者含量在總大豆異黃酮含量占比為88.0%～93.4%，這與大豆原料本身的異黃酮組成一致[13,18]。結果表明,本研究建立的UPLC法可有效降低雜質干擾,色譜基線穩定且峰型良好,在10 min內實現對6種大豆異黃酮的快速定量檢測,可良好應用于常見市售豆制品的營養評估與質量控制。

表3 豆制品中6種大豆異黃酮的檢測(n=3)Table 3 The analysis of six isoflavones in soybean products

圖2 260 nm下的不同豆制品中大豆異黃酮的UPLC色譜圖Fig.2 The UPLC chromatograms of isoflavones in different soy foods at 260 nm

3 結論

本方法在酸性條件下，將豆制品中主要的大豆異黃酮修飾物水解，使其葡萄糖苷配基上的丙二酰和乙?；妊苌鶊F解離，生成對應的糖苷型大豆異黃酮，從而將豆制品中可能存在的12種以上異黃酮物質降低為6種標準品易得價格相對低廉的三種葡萄糖苷和三種苷元。色譜分析采用乙腈和0.1%甲酸(V/V)梯度洗脫，在8 min內實現6種大豆異黃酮的基線分離，并在梯度洗脫起始階段設計了0.5 min的10%乙腈等度洗脫以排除嘌呤堿類化合物對檢測的干擾。建立了6種大豆異黃酮的標準曲線方程，其中大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷的線性范圍為0.3～100 mg/L，大豆苷元和黃豆黃素的線性范圍為0.15～50 mg/L，染料木素的線性范圍為0.15～250 mg/L。三個添加水平(0.5,5,20 mg/kg)的大豆苷、染料木苷、黃豆黃苷回收率在96.5%～99.8%之間，三個添加水平(0.1,1,5 mg/kg)的大豆苷元、黃豆黃素、染料木素回收率在96.7%～102.3%之間，達到分析測試要求。利用本方法對腐竹、豆干、素百葉、素雞、嫩豆腐、老豆腐和內酯豆腐等7種我國傳統豆制品中的大豆異黃酮進行了定性定量分析，總大豆異黃酮含量在8.67～25.83 g/kg間。不同豆制品間均以6種大豆異黃酮中大豆苷和染料木苷為主要成分，占88.0%～93.4%。結果表明，本研究建立的UPLC法可有效降低雜質干擾，色譜基線穩定且峰型良好，在10 min內實現對6種大豆異黃酮的快速定量檢測，可良好應用于常見市售豆制品的營養評估與質量控制。

[1]姜雪,遲玉杰,許巖,等. 大豆異黃酮代謝終產物:雌馬酚的研究進展[J]. 食品工業科技,2012,33(19):401-403,408.

[2]Toi M,Hirota S,Tomotaki A,et al. Probiotic beverage with soy isoflavone consumption for breast cancer prevention:a case-control study[J]. Current Nutrition and Food Science,2013,9(3):194.

[3]Tse G,Eslick G D. Soy and isoflavone consumption and risk of gastrointestinal cancer:a systematic review and meta-analysis[J]. European Journal of Nutrition,2014:1-11.

[4]丁剛強,高潔. 中國居民營養的發展與挑戰[J]. 中國食品學報,2016,16(7):1-5.

[5]劉琴,牛文慧,張薇娜,等. 大豆與大豆芽中異黃酮的含量、組成及比較研究[J]. 食品工業科技,2013,34(21):60-64.

[6]張海軍,蘇連泰,李琳,等. 高效液相色譜法(HPLC)測定大豆異黃酮含量的研究[J]. 大豆科學,2011,30(4):672-675.

[7]張海軍,王英,王慶鈺. 大豆異黃酮檢測方法研究概述[J].糧食與油脂,2011(3):39-42.

[9]孫冬梅,董玉娟,胥愛麗,等. 基于 UPLC/Q-TOFMS 的大豆異黃酮保健食品中異黃酮成分的快速分析[J]. 世界科學技術-中醫藥現代化,2015,1:22.

[11]Lu J,Xie Y,Tan Y,et al. Simultaneous determination of isoflavones,saponins and flavones in Flos Puerariae by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole time -of-flight mass spectrometry[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin,2013,61(9):941-951.

[12]Gaya P,Arqués J L,Medina M,et al. A New HPLC-PAD/HPLC-ESI-MS Method for the Analysis of Phytoestrogens Produced by Bacterial Metabolism[J]. Food Analytical Methods,2015:1-11.

[13]Shuang Zhang,Zong-Ping Zheng,Mao-mao Zeng,et al. A novel isoflavone profiling method based on UPLC-PDA-ESI-MS[J]. Food Chemistry,2017,219:40-47.

[14]Gasparetto J C,Smolarek F S F,De Francisco T M G,et al. Development and validation of an HPLC-DAD method for analysis of the six major isoflavones in extracts from soybean processing[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,2012,89(7):1211-1222.

[15]袁波,甄慧娟,姜璇,等. UPLC法測定大豆制品及相關制劑中大豆異黃酮含量[J]. 食品科學,2013,34(8):164-167.

[16]You-Shin Shim,Won-Jin Yoon,Jin-Bong Hwang,et al. Rapid method for the determination of 14 isoflavones in food using UHPLC coupled to photo diode array detection[J]. Food Chemistry,2015,187:391-397.

[17]Aguiar C L,Haddad R,Eberlin M N,et al. Thermal behavior of malonylglucoside isoflavones in soybean flour analyzed by RPHPLC/DAD and eletrospray ionization mass spectrometry[J]. LWT-Food Science and Technology,2012,48(1):114-119.

[18]Yerramsetty V,Mathias K,Bunzel M,et al. Detection and structural characterization of thermally generated isoflavone malonylglucoside derivatives[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry,2011,59(1):174-183.